二附院基于温病理论的人感染h7n9禽流感肺实热证小鼠模型建立及加味麻杏石甘汤干预机制研究

1、为建规范的协同创新项目信息管理制度，加强项目信息的管特设计山东省高校抗协同创新中心项目可行（报书格式和填写要一、请严格按照表中要为建规范的协同创新项目信息管理制度，加强项目信息的管特设计山东省高校抗协同创新中心项目可行（报书格式和填写要一、请严格按照表中要求填写各二、项目可行可以由一组织，也可以由多联合组织，牵为项目组织实施的责。每个项目只能有一家责和一个组三、项目可行由项目责编写，并报抗协同创新中心管四、项目可行中第一次出现外文名词时，要写清全称和写，再出现同一词时可以使用缩五、组织机构代码是指项目责组织机构代码证上的标识代它是组织机构代码管理中心所赋予的唯一法人标识代六、编应客观填材料，尊

2、重他人知，守国家有关知。在项目可行中他人研究成果时必须以脚注或其他方式注明目的应是介绍、评论与自己的研相关的成果或说明与自己的研究相关的技相关的成果或说明与自己的研究相关的技术问题。对、篡改科学据他人著作或者剽窃他人科研成果等科研不端行为，一经实，将记入信。七、此表为项目可行的基本信息，请务必填写正一、项目基本. 411904一、项目基本. 411904女123（万元3030二、项目简二、项目简H7N9禽流药物等工作提供了适合的病证结合动物模型，同时也为治二、项目立项的二、项目立项的必要性2.1(AvianInfluenza,A1)A 型流感 引起的家禽或野禽的一种感染和或疾病综合征。人 (h

3、uman avianin fluenza, HAI)是人接触被污染的排泄物、 物或气溶胶而 ，并出现以呼吸道 、黏膜充血等为主要表现的人禽共患病，部分 高致病性 毒株的患者可出现呼吸衰竭和多 损害， 率高，己被国际兽医局列为 A 类烈性传染病。在荷兰、国大陆 10 余个省均发生人 H7N9 流感。4 月 24 日，也发现 H7N9确诊病例。截至 2013 年5 月8 日，130 例，其中31 例，康复 42 例。其中者33例，死亡 13 例。人症状。起病 5-7d 出现呼吸事件，此外，有 3 例家庭，这可能表明 H7N9【1-2对禽类和人严，因此有必要建立实验动物模型并开西药防主要是通过切的途

4、径来进行治疗，主要 是 烷胺口服时生物利用度太低，“达菲”易产生严重副作用， 唑有致畸性。中药防治的主要优势是中药含有多种活性成分，对 的杀灭作用机多种 有效，对 的防治作用明显。根据国家卫生与人 H7N9 诊疗方案（20131【3（20132【4中医药辨证论治在 防治中的作用受到肯定并得 。中医学中没有 的病亦高，常表现为肺实热证。肺实热证指火热炽盛，壅积于肺, 肺失清肃，以咳喘气粗、鼻翼扇动等为主要表现的实热症候，在卫气营血辨证中属气分证。总结 本课题组拟 期研究基础上，采用现代医学病因病理造模方法，模拟人感染H7N9用的人H7N9演 变，并用加味麻杏石甘汤对该小鼠模型进行干预，通过观察模

5、型小鼠的一般情 T群CD+、 CD8+2(IL2)6(IL6)(INF-)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、肿瘤坏死因子-（TNF-）表达水平、测定、抗体测定、白细胞计数、肺指数等指标的改变，多层面评价该病证小鼠模型的可靠性和稳定性，阐释该小鼠模型的自然病机演变规律以及加味麻杏石甘汤对其的人H7N9行性研究、开发有效和中药抗药物等工作提供了适合的病证结合动物模型，同时也为中抗治疗提供理论支撑和新的思路。国内外建立 动物模型方法很多，各有优缺点，尚无一种公认的最优的方法。判断模型是否成功的指标，最重要的就是在被 动物体内分离出同种病毒。己有人源或禽源 引起不同鸟类、大小鼠、猪、家猫、雪貂和灵长类动物

6、致病性的研究 ，鲍琳琳等【5】的动物模型，A 型和 B 型流感 都可在雪貂上直接 不需要经过传代适应,雪貂的解剖结构分为上下气室，有利于研究流感 对不同气室的 。雪貂后的变化与人 后的变化是相似程度较高【6。也有研究认为，后的变化与人 后的变化是相似程度较高【6。也有研究认为，较大规模的动物易感性和抗 治疗等机制的研究，是模拟流感 的理想动物模型【7。黎东明等【8】H5N1 H5N1 病毒性 模型，以研究其发病机制。但从实用性考虑，小鼠有体形小、品系多、易获得、操作方便等突出优点，研究表明，AIV 小鼠并致死的分子毒力机制同样对哺乳动物起作用【9AIV 哺乳动物发病机制的重要实验动物【10-1

7、2。为预防 的 ，近年来许多学者探索了 的 及 方式，陈霆等【13-14】H7N9 小鼠与同居小鼠合笼，通过观察同居小鼠的发病H7N9 在同笼小鼠中的 能力，证实 H7N9 可以不通过适应就 小鼠，引起小鼠间 。中医温病动物模型的 难度是较大的,，目前尚无 肺实热证病证结合造模相关研究，关于肺实热证造模的方法也较单一，杨萍等【15】将 链球菌菌液性 模型，并给予热环境风热刺激 细菌性 痰热证模型。因此，建立一种符合中医病因病机理论且具备可 性的中医肺实热证证候模型是必要的。2.2.2 管理局 2014 年颁布的人 2.2.3肺损伤的发生,促炎因子如 IL-1、IL-8、TNF-a 等会急剧升高

8、,如果抗炎因子以抵抗促炎因子的作用, 导致细胞因子初步揭示细胞因子IL-1、TNF-、IL-8、IL-IO、RANTES、ICAM-1在CD8+T 及其他呼吸道 过程中发挥重要的作用，并可以提供短期的保护性细胞免疫防止疾病复发，当 进入体内，由类浆细胞样树突状CD4CD8+T迁移，CD4+T 辅助细胞主要负责通过细胞-细胞相互作用或 细胞因子辅助其他免疫细胞识别 多肽并结合主要组织相容性复合物类分子 CD8T病原有防卫功能，并具有 清除作用，还可 一些抗 细胞因子等，当抑CD8+T白细胞介素-2( erleukin-2,IL-2TTH1 T细胞快速地增殖和分化。TT细胞快速地增殖和分化。TIL

9、-2IL-2又作用于 T 细胞自身，诱导自身增殖、分化和发挥功能。流感 过程中，IL-2 是具有保护作用的细胞因子。IL-2增CTL胞穿孔素 的表达。IL-2进诱导 B细胞增殖、分化和免疫球蛋白 【25。IL-6IL-6它是 B 细胞产生抗体所必需的，也能促进 T 细胞及胸腺细胞增殖，也可以诱导各种急相蛋白产生【26，是一种重要的前炎症因子。IL-6降低。IL-6 又可被 IL-10 所抑制。机体遭流感 后可引 IL-6 表达上调。肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-, TNF-)是由 3 单核-巨噬细胞TNF-(约109mol/L)主要通过自IL-1、IL-6 等细胞

10、因子，间接增强其本身效应。高浓度 TNF-可进入血循环，以内细胞因子介导的炎症反应，提高血循环中IL-1、IL-6的含量，放大细胞因子介导的 辛寒，而辛寒大于辛温，不失为辛凉之重剂; 杏仁宣利肺气为佐，助麻黄以止咳平喘调和诸药为使【29】诊治指导方案）对于 的进展期证属邪毒壅肺，治宜清热解毒，泻肺平喘，方用麻杏石甘汤和葶苈大枣泻肺汤加减。研究发现，麻杏石甘汤体内外均有较明显的抗流感 作用。卢芳国等【30-33】对麻杏石甘汤的抗 A 而发挥抗流感 作用，并且能通过抑制 A而发挥抗流感 作用，并且能通过抑制 A 型流感 感MDCK 细胞活性与超微结构，因此，该方主要是通过直接 、干预 吸附、抑制

11、增殖、保护宿主细胞的机制而发挥抗流感 作用。除此之外，麻杏石甘汤通过调节的蛋白表达水平，对机体抗 免疫发挥一定调节作用。李玲【34】A 型流感 小鼠肺适应株动物 模型，观察麻杏石甘汤对小鼠免疫 质量指数和 IL-2、TNF-蛋白表达水平的影响，结果表明麻杏石甘汤具有影响流感 小鼠细胞因子蛋白表达水平，调节免疫网络的功能。 等【35】研究麻杏石甘汤能明显减轻流感 小鼠肺部炎症反应，降低肺指数，其机制可能与其抑制神经氨酸酶活性， 增殖有关。陈尧高【36】对流感 8085%。 、腮腺物碱,并且这 3 个部位在抗 FM1 过程中，三者叠加起来的抗 的发育。杨子峰【40】等发现板蓝根水提物 S-03 能

12、够抑制流感后能显著提高巨噬细胞吞噬率及吞噬数，增强机体的淋巴细胞数，增强机体的淋巴细胞转化率,并且增强 Th1 细胞【1】 Li Q,Zhou L, Zhou M,et al,Preliminary report: demiology of the avianinfluenzaAH7N9)outbreakinChinaJ.EnglJMed2013April 24Epub ahead of pr【2ParryJ,H7N9 ismoretransmissbleandhardertodetect n H5N1,say expertsJ.BMJ 2013;346;f2518【3】国家卫生.人 H7N9

13、 诊疗方案(2013年第).2013,National Heal nd Family Planning Commis of the Peoples Republic of China.Diagnosis and Treatment Program of Hum indH7N9AvianInfluenzaInfection(the1st edition,2013),2013.【4】国家卫生.人 H7N9 诊疗方案(2013年第).2013,National Heal nd Family Planning Commis of the People,s Republic of China. Diag

14、nosis and treatment program of hum indH7N9avianinfluenzainfection(the2nd【5 流感 H3N22011,21（8：5-【6BelserJAGustinKM,PearceMB,etal.PathogenesisandLowenACMubarekaS,TumpeyTM,et,al,Theguineapigasafor human JPNAS，2006,103(26):9988-【8】 黎东明等，恒河猴 H5N1，2014,30（8：806-【9Dybing J【9Dybing J K,Sehultz CS, Swaynede,

15、et al.Distinet Pathogenesis originHSNI es ieeComParedto tofOther Highly Pathogenie HAS vian Influenza es J.J. Viro l,2000,74(3):1443 一 1450.【10】PengG,WatanabeSJ,ItoS,etal.BiologiealHeterogeneityineluding SystemieReP ation ieeofHS nfluenzaA isolatesfrom humansin J.J.Virol,73(4):31843189.【11】LuXH,Tunp

16、eyW,MorkenT,etal.AMouseM fortheEvaluationof PathogenesiSadImmunitytoInfluenzaA(HSNI) esisolatedfrom HumansJ.Journalof virology,1999,73(7):5903 一 5911.【12】ChenH,DengG,LIZ,etal.TheEvolutionofHS nfluenza esin Du ksin Southern ChinaJ.PNAS,2004.101(28):1045210457.【13】陈 霆，鲍琳琳，朱 华，等，新型禽源人流感H7N9 的小鼠，2014,24

17、（1：52-【14】鲍琳琳，朱 华，等，新型 H7N9，2014,22（1：27-，2014,20（6：162-2009,5（9822-【17】余小萍.人 中医防治对策A.见: 颜德馨中 .中 防治人 培训班C.中 防治人 培训班.同济大学中医研究.2006. 【18】王永恒.自拟“双翘解毒汤”加减对人 的辨证论治探讨J.光明中19 J，2013,28（10：2825-2009 年流感暴发的 H1NA 新型流感微生物学免疫学进展,2012,40 (3): 79-82.J.药学学报,2012, 47 (6): 730-中国中药杂志,2012, 37 (20): 3068-3073.【25.细胞和

18、分子免疫学:科,2001,2:135-【26】任蕴芳,唐佩弦.白细胞介素 6 研究进展医（4）:195-,1998,1:49 一 71.【28】Van Cen H.Influenza Areplication is inhibited by tumor necrosisfactoralphainvitro.ArchVirol,1994;136(3-4):439一，2010，16（15：244-【30】卢芳国，何迎春，肖子曾等，麻杏石甘汤体外抗 A 型流感大学学报，2008 (2)5-9【31】卢芳国，何迎春，肖子曾等,麻杏石甘汤对 A 型流感学报，2009，22( 2) :185-188【32

19、】卢芳国，何迎春，庞喻等，麻杏石甘汤对 A 型流感大学学报，2010，30(9):47- 小鼠IL-2IL-蛋白表达水平的影响J,中华学刊，2011，29(3),475-【34】李玲，卢芳国，熊兴耀，等，麻杏石甘汤对A型流JJ，2013，28（4：1094-2011（18）:135-J.辽宁中医杂志,2011 (12): 2444-.板蓝根中 11 个化学成分抗医急症,2011 (11): 1772-1774.警医学院学报,2010 (9): 689-691.,秦蜜.板蓝根水提物 S_03 体外抑制甲-乙型流感学报,2011, 27(3); 218-220.【41 】杜德安. 白云山板蓝根具有

20、多靶点抗作用J.【43】,朱萱萱,倪文澎,等.提取物抗的作用研究.中国【45】包信通，郭承军，王 锋.医国药, 2013,4(3):583-584.三、项目内容和三、项目内容和研饮水量、尿量、体重、被毛情况及有无弓背、竖毛、蜷缩、颤抖和 等。病理观察：造模后1、2、3、5、7、14、28，随机挑3小鼠 ，取心、肝、脾、肾、脑、肠用于病理标本 ，病理标本 方法采用 固定，石蜡包埋、切片，HE 和免疫组化染色。肺组织病理观察：造模后第 1、2、3、5、7、14、28 天，随机挑选 3 只小鼠安乐死，用生理盐水对肺组织进行 ，取肺泡 液和肺、心、肝、脾、肾、脑、肠等组织接种到 MDCK 细胞，观察细

21、胞病变。4%多聚 液中固定，按常规脱水、石蜡包埋、切片，免疫组织化学染色法检测 IL-2、TNF-、TNF-水平；测定：造测定：造模后第 1、2、3、5、7、14、28 天，随机挑选 3 只小鼠用 RT-PCR 方法检测肺、心、胸腺、肝、脾、肾、脑中的抗体测定：攻毒后第 14 天H7N9禽通过动态监测（24h）模型小鼠一般情况及肺、心、肝、脾、肾、脑、肠等组织的病理改变、 测定、抗体测定、白细胞计数及肺指数计算，阐释该（1）（1）采用对照、完全随机两层分组设计的方法，将 SPF 级雌性 BALB/c 小鼠 399 只随机313-15g,，空白对照组（A）93 只、 小鼠模型组（B） 153 肺

22、实热证组（C）1533人 H7N9 小鼠模型造模：将B、C组小鼠，参考朱华（朱华等，中国实验动物学报，2014 年）等人采用的西医疾病造模方法：小鼠用浓度为 20mg/ml 的盐酸 注射液肌肉注射麻醉，麻醉剂量每只小鼠0.1ml，将50l1*106TCID50 中医证候造模：根据叶天士温热 ：“温邪上受，首先犯肺，温邪则山东中 大学，2010年）采用的中医造模方法，以其建立的肺实热比妥钠溶液，待小鼠麻醉后，将其固定于解剖台上，头低位 声门，将静脉套管针沿气管走行快速 气管，拔出针芯，接lml注射器，1秒钟内注入溶于注射用生麻黄 9g，杏仁 9g，X出的人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值，计

23、算小鼠的 有效生药量，并根据实际操作要求，将小鼠给药浓度浓缩 1 倍，每次 0.2ml，每天 1 次，持续至实验西药干预组：B2、C2X出的人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值，计算小鼠的 有效生药量，并根据实际操作要求，将小鼠给药浓度浓缩 1 倍，每次 0.2ml，每天 1 次，持续至实验西药干预组：B2、C2 7Omg/kg，0.2mL/d计量资料以 S 表示，多组间比较用单数资料用2 检验，P0.05 为显著性差异，P0.01 为非常显著性差异，数据应用 2015/01-2015/06 准备工作，进一步查阅相关资料，完善实验方案，完成综述性文1； 实验动物、实验试剂、实验药品，准备实验

24、场地等工2015/07-2015/12 建立并多层面评价人 (H7N9)小鼠模型；进行药物干预2016/01-2016/06 收集观察检测指标，分析各指标间的关系， 相关 SCI ，申请相关专利 1-2 项；2016/07-2016/12 20152015.06验完成；2015.122016 20152015.06验完成；2015.122016相关 SCI专利 1-2 项2016.06析完毕；2016.123.4（万元人H7N9H7N92015.063.4（万元人H7N9H7N92015.062015.125四、项目技术路线、知对策及市场项目技术路线及其先进性和可行性分析（说明其主要技术创新点

25、四、项目技术路线、知对策及市场项目技术路线及其先进性和可行性分析（说明其主要技术创新点SPF级BALB/c399肺热证组）93 （B组）153模型组（C 组）常规原液滴原液滴养第1+气管滴注多糖造模，7、1428天各取328 天检测设计取 3 标，随机将3 只检测设检测中90 只小指标，随机计指分为3其中90只小空白对 自 然 唑 中 药 自然 唑 中药干照组 演 变 干预组 干 预 演变 干预组 预 组 A 组 30组 B1B2 组 组 B3组C1C2 组 C3 组组 3030 只 组 30组30 30 只 30 只 ，实验设备先进，能够保证课题所需要进行的免疫组化、 Wetern-blot

26、、RT-PCR 等检测技术顺利进行。知和技术标准分析及对策（含国内、国际竞争力分析人 H7N9 的传染性、高致死率显示了巨大的市场，通过加强国内相关制药企业应和高校、科研机构的联系，做到强强联合，实现人 H7N9 发病机制研究、 基础性和预防性研究、开发有效 和中药抗 药物方面的重大突破，其国内国外竞争力必将有大幅度 ，必将带来巨大的社会和经济效益。人 A直接 人，甚至可能出现人传人的现象，对禽类和人类 严重 。因 变异迅速及药物本身的副作用，目前西医多以对症治疗和抗 治疗为主，并无针对性 物，而中医千百年来在防治不同时期的各种传染性疾病方面积累了大量宝贵的经验，是弥补生物 、化学药(西药)治

27、疗缺陷的有效方法，在当前防治人禽流感的发病机制、进行 基础性和预防性研究、开发有效 和中药抗 药物等工作的开展具有重要意义，本研究 乃至世界范围人 的预防和治疗工作,具有 而实际的价值和意义，也进一步产生巨大的社会效益和经济效益，为人类带来 ，为人类社会的 来深远意义。五、基础条件五、基础条件申请人所在 山东中 大学第二附属医院 (山东省中西医结合医院)创建于1904年,是山东省首批、济南市第一家综合性三级甲等医院。2012年1月入选全国第三批重点中西医结合医院建设 ；2012 年9 国家中管局评审成为 三级甲等中西医结合医院。医院是国际爱婴医院；省直 定点医疗机构；山东省康复治疗技术定点培训

28、医院；山东省农村儿童 性心脏病医疗保障定点医院；国家中 管理局“”预防 服务试点 ；国家中 管理局中医医院中文化建设试点 ；财政部、国家中 管理局中 预防 及康复与临床服务能力建设 ； 重点中西医结合医院建设 。拥有山东省中西医结合防治技术 ，包括分子生物学、细胞学、免疫学及药理、毒理学研究室，能为本项目开展提供仪器、技术支持和信息 。 具备本项目研究相关仪器设优化，促进科技资源高效配置，提高科研能力。目前拥有国家和 学科、专科、 、国家和省级名老中医 共48个，其中国家临床重点专科3个、国家中 管理局重点专科 7 个、重点学科 4 个，2 个； 专科9 申请人所在 现有 4国家中 管理局 3

29、 三级 ，2国家中 管理局 ，设有分析测试中心、化学 、药学 等。本项目申请单位拥有山东省中西医结合肿瘤防治技术 ，包括分子生物学、细胞学、血液学、免疫学、微循环学及药理、毒理学研究室。 具备本项目研究相关的细胞生物学、分子生物学、药理学等方面的各种仪器设备，如超净工作台、 显微镜、微循环显微镜、Panasonic 彩色 机、 BDcoulter c3xl-4荧光分光光度计、PCR 自动系列分析仪、计算机微循环图像处理系统、紫外投射仪等，可进行各类细胞培养、MTT 实验、免疫组化实验等多种实验研究。5.3职专目工作时（人月证件类证件所 女岁项目 女岁 5.3职专目工作时（人月证件类证件所 女岁项目 女岁 男岁副无 女岁无 女岁无 男岁无 女岁无 男岁无 女岁无 项目 及主要骨干 的情况(项目 及主要骨干 的情况(从事过的主要相关研究及所负责任和作用，相关研究和 成果、发明专利和获奖情况，在国内外主要 上级、省部级科研项目 10 余项，在国内外重点期刊杂志上40 余篇，获省部级科研奖项 7 项。在本课题是项目相关性研究 获山东