无菌及微生物检查方法验证课件

1、无菌检查及微生物检查方法无菌检查及微生物检查方法 介绍内容一、微生物的基础知识二、无菌检查方法 微生物基础知识 微生物（microorganism, microbe）是一些 肉眼看不见的微小生物的总称。 微生物（microorganism）包括细菌、支原 体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌 （霉菌、酵母菌和放线菌）等。 微生物基础知识 微生物（ 细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式繁殖。 细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其特点 细菌的形态细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观 察难以看到，其结构和形状须经过显微镜

2、放大数百 倍至上千倍才能观察。一般以微米（m）作为测量单位。在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌 和螺杆菌。经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。 真菌（fungus；eumycetes） 是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在基质上生长的形态称为菌落。 真菌（fungus；eumycetes） 真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单细胞呈圆形或卵圆形，

3、如酵母菌（yeast）。多细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。 真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小 药品污染常见的真菌 毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属 一、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。 药品污染常见的真菌 毛霉属、根霉属、曲霉根霉属（RhizopusEhrenberg） 根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。根霉属（RhizopusEhrenberg） 根霉属广泛 曲霉属（Aspergillus） 曲霉属的菌丝无色、淡色或

4、表面凝聚有色物质，为有隔的多细胞。本属的常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的致癌性。 曲霉属（Aspergillus） 青霉属菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属的常见产毒霉菌有9个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性； 霉菌菌落形态 霉菌菌落形态 霉菌在孟加拉红培养基上的形态 霉菌在孟加拉红培养基上的形态 酵母菌显微镜下形态 酵母菌显微镜下形态 无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、

5、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查法 无菌检查 无菌保障 试验环境 检验依据 无菌保障 试验环境 隔离系统的应用 应用隔离系统重要的目的是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次检出的要求。是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染。 隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。 日常检验还需对试验环境进行监控。 隔离系统的应用 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基 培养基 制备培养基的要

6、求 培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结 束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度1/2。 培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。 配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 制备培养基的要求 培 培养基的贮存 制备好的培养基应在2-25、避光保存； 保存在非密容器中，应在3周内使用；保存在密闭容器中，可在1年内使用。 培养基的贮存 制备好的培养基应在 培养基的适用性检查 无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支，培养14天应无菌生长。试验可与无菌试验同时进行。灵敏度检查 培养基的适用性检查 无 菌 种

7、 菌液制备黑曲霉菌液的制备培 养 基 接 种参照中国药典2010版 菌 种 结果判断 空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 试验同时应做空白对照 结果判断 稀释液、冲洗液 0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。 如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。 稀释液、 阳性对照 根据供试品特性选择阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌 抗革兰阴性菌 抗厌氧菌 抗真菌 加菌量 结果判断 阳性对照 阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液

8、、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 阴性对照 无菌检查法 包括薄膜过滤法和直接接种法。 只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。 无菌检查法 包括薄膜过滤 薄膜过滤法 过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般薄膜过滤器。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。 薄膜过滤法 可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品。水溶性供试品直接过滤。可溶性固体制剂供试品。装有药物的注射器供试品和具有导管的医疗器具的供试品。可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品。 直接接种法 供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养基量应符合接种的供试

9、品体积不得大于培养基体积的10%。同时硫乙 醇酸盐培养基不得少于15ml、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基用量和高度应经方法验证。 直接接种法 培养及观察 培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌3天，观察有无菌生长或镜检进行判断。 阴性对照不得有菌生长。 培养及观察 结果判断 若供试品管均澄清，或虽显浑浊无菌生长，判供试品符合规定。 若供试品中任何1管显混浊并确证有生长供试品不符合规定。 除非能充分证明，检出的微生物非供试品所含。 当符合下列至少一个条件时，方可判复试。 对无菌检查试验所用的设备及环境的

10、微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。 回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染的因素； 阴性对照管有菌生长。 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定，若有菌生长判供试品不符合规定。 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌 方法验证的必要性为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确的检验方法是至关重要的。因此试验前必须对选择的方法进行验证。 证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方法适宜于被检供试品的微生物污染的检验。 药

11、品无菌检查和微生物检查方法验证 方法验证的必要性 药品无菌检查和微 检验结果的影响因素供试品的组分 环境影响 检验方法检验条件 检验结果的影响因素供试品我国无菌和微生物检验方法验证的概况国外无菌和微生物检验方法验证的概况国外无菌和微生物检验方法验证的概况 我国无菌和微生物检验方法验证的概况国外无菌和微生物检验 药品微生物检验方法验证的基本要求 验证试验的设计需综合全面考虑，主要有以下几方面；供试品特性检验目的 试验全方面验证 药品微生物检验方法验证的基本要求 验证试验的 当验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试品对微生物无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品检验结果可真实的体现。 当

12、验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试品对 重新验证 药品的生产工艺、制剂组分、检验方法或检验条件发生改变时，应重新进行验证，以确认所发生的变化不影响该药品中的微生物检查。 重新验证 验证试验用菌株的要求 验证试验用菌株应有代表性。 试验菌株应选择非致病性菌株。试验菌宜选择比较稳定、重现性强的菌株。 菌株传代次数不得超过第五代。 验证试验用菌株的要求 验证 试验用菌株的储藏 菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但不至于死亡，以减低菌种的变异率。 试验用菌株的储藏 标准菌株的复活或培养

13、物的制备应按供应商提供的说明或按验证的方法进行。 标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按验证 低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以 抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、干 燥和真空是菌种保藏的重要手段。 标准储备菌株经纯度和特性确认后保存时，可将 培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装 于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥，液氮储存， 超低温冷冻(低于-70)等方法保存。 低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再次使用。 工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后

14、,不得重新冷冻或再次使 不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段： 不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法，菌挑选特征典型的纯菌菌落。确定保藏的合适菌体形态。选择最适宜的方法保藏。定期对保藏的菌种进行检查。挑选特征典型的纯菌菌落。 菌种的传代和使用 工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5 代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代） 防止过度的传代造成菌种变异。 1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中， 任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进 行确认。 菌种的传代和使用 工作菌种的传代次 菌悬

15、液的制备与保存 参照中国药典2010版附录菌悬液的制备与保存。 菌悬液的制备与保存 供试品抑菌活性的处理对含抑菌活性的供试品在进行微生物检查前，应对抑菌活性进行处理，验证试验可根据供试品的物理或化学特性选择下述方法来消除抑菌活性；培养基稀释法中和法薄膜过滤法离心沉淀法 供试品抑菌活性的处理对含抑菌活谢谢谢谢树立质量法制观念、提高全员质量意识。9月-229月-22Monday, September 26, 2022人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。15:32:5215:32:5215:329/26/2022 3:32:52 PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦绷。9月-2215:32:

16、5215:32Sep-2226-Sep-22加强交通建设管理，确保工程建设质量。15:32:5215:32:5215:32Monday, September 26, 2022安全在于心细，事故出在麻痹。9月-229月-2215:32:5215:32:52September 26, 2022踏实肯干，努力奋斗。2022年9月26日3:32 下午9月-229月-22追求至善凭技术开拓市场，凭管理增创效益，凭服务树立形象。26 九月 20223:32:52 下午15:32:529月-22严格把控质量关，让生产更加有保障。九月 223:32 下午9月-2215:32September 26, 2022作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2022/9/26 15:32:5215:32:5226 Sep