羊水细胞培养技术在产前诊断的应用

1、羊水细胞培养技术在产前诊断的应用摘要目的：利用羊水细胞培养方法，胎儿染色体核型分析进展染色体病的产前诊断。方法：采用羊水细胞培养技术，建立收获标准及改进收获方法,对270例孕妇胎儿进展了羊水穿刺术及羊水细胞培养。结果:羊水培养成功率为96.30%,缩短了培养时间(9d10d)。结论:羊水细胞培养技术，培养成功率高、培养时间短、可分析核型多,便于临床开展。关键词羊水;细胞培养;产前诊断羊水细胞培养及染色体制备是染色体病产前诊断的主要手段。由于羊水细胞培养一直存在技术要求高、难度大、培养时间长、易污染、分裂相较少等问题,许多单位仍未能开展羊水产前诊断工作。近10年来,世界各地对羊水细胞的培养及其在

2、染色体制片上虽不断有所改进,但羊水细胞培养与制片仍有一定难度。近3年来,我们对羊水细胞培养方法进展了探究和改进,并进展了270例羊水染色体的制备,效果满意,现报告如下。1资料与方法1.1病例来源200例为陕西省妇幼保健院遗传优生及产前诊断门诊中有产前诊断指征的患者，70例为外院送检患者。1.2方法1.2.1羊水采集在孕17周23周进展穿刺。常规消毒,B超引导下采用22号穿刺针穿刺,最初抽取的1l2l羊水弃去,换另一注射器抽取羊水20l30l,注入无菌离心管中送检。羊水中少量红细胞不需处理,如有明显血性羊水,立即在羊水中参加无菌肝素1滴，标本尽快送实验室接种。1.2.2羊水细胞培养将羊水以120

3、0r/in1500r/in离心10in,弃去上清液,保存0.5l羊水细胞层,以滴管打匀,接种于1252培养瓶(鼎国公司提供),并参加羊水培养液3lAniax混匀,置于5%2培养箱中半开放式培养。第5天开场观察，假设观察到有较好的梭形细胞克隆那么更换培养液。用一次性滴管吸干原来的培养液后,参加新颖培养液4l。于收获前1天或收获当天再换液1次。收获时在培养终止前3h参加秋水仙素,最终浓度为25g/l。1.2.3羊水细胞收获收获细胞时,根据细胞生长旺盛程度采取收获方法。在细胞生长相对量少时，采用原位法。将培养液倒出，参加0.6%的柠檬酸钠10l于培养瓶中37.0，低渗40in，弃液，用31甲醇冰醋酸

4、固定液固定2次后，敲开培养瓶，获取培养瓶细胞生长面塑料片1张2张，55烤片过夜。在细胞生长相对量多时，用吸管将细胞吹打后倒入离心管中,在每个离心管内参加8l已预温至37的0.6%枸橼酸钠低渗液,每管低渗10in,用31甲醇冰醋酸固定液固定后，滴片1张2张,55烤片过夜。胰酶法G显带。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISN1995)标准进展核型分析诊断。2结果2.1成功率270例标本中,成功260例,一次性培养成功率到达96.30%。2.2培养时间培养收获时间大多数为9d10d,最早收获在第7天,最长14d。2.3核型效果每例羊水培养可获得1张2张染色体玻片或培养瓶塑料片,每片可获10个20个分

5、散较好的分裂相。3讨论3.1羊水培养首先必须有好的培养基传统的培养基是在F10中参加一定比例的胎牛血清,由于营养成份较少,羊水细胞培养所需时间较长,培养成功率低。国内有些学者通过添加生长因子或用血清代用品1来培养羊水,但步骤繁琐,也容易造成污染。我们采用Aniax培养基,因其营养成份较齐全,省去了添加生长因子等步骤,方便省时、收效率高。本实验270例羊水细胞均生长良好,形成的圆形、双圆形细胞较多。一次性培养成功260例,成功率为96.30%,比文献报道的91.6%2及92.08%3略高,可能与培养基的改进、孕周的选择以及病例数相对较少有关。3.2建立收获标准要收获较多的分裂相,必须在适当的时机

6、收获。我们于10倍目镜和10倍物镜下观察:以梭长形羊水细胞(AF细胞)为主要类型的生长细胞,形成的细胞克隆覆盖1个或1个以上的完好视野；培养瓶中有2个3个以上细胞克隆,且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、双圆形或葡萄状透亮细胞；细胞克隆中央的细胞开场老化,克隆周边细胞生长旺盛。3.3改进收获方法我们根据细胞生长密集程度，采用原位法或改用特殊玻璃长弯吸管吹打搜集细胞，两种方法结合使用，进步了实验的成功率。3.4血性羊水处理羊水有严重的血细胞污染时,立即在羊水中参加无菌肝素1滴,尽快离心接种,防止红细胞凝集时把羊水细胞也凝集起来4,并采取提早换液及屡次换液的方法,同样也可获得成功。本组2例严重的血性羊水,用该方法培养获得成功。3.5关于抗生素的应用由于抗生素在抗菌的同时也抑制了羊水细胞的生长,故主张尽量不用或少用。如疑心羊水受细菌、霉菌或支原体污染时,应考虑使用，用量一般与组织培养一样。我们曾有2例羊水培养时,细胞生长良好,与一般的培养无异,但换液后发现有污染迹象,羊水细胞的正常构造也遭到破坏,疑为支原体污染，及时添加了抗生素,终于收到满意的分裂相。参考文献：1丁显平.血清代用品在羊水细胞培养染色体分析中的应用J.中华医学遗传学杂志,2002,19(2):1802.2冯怀英,朱宝生,孟昱时,等.妊娠中晚期羊水细胞胎儿染色体异常核型分析J.中国优生与遗传杂志,20