银杏叶提取物对6OHDA诱导PC12细胞Bax和Bcl2表达的影响

1、银杏叶提取物对6-OHDA诱导PC12细胞Bax和Bcl-2表达的影响【摘要】目的讨论银杏叶提取物Ginkgbilbaextrat,GBE对6-羟基多巴胺6-hydrxydpaine，6-HDA诱导的P12细胞凋亡的保护作用及其机制。方法经不同浓度GBE预处理体外培养的P12细胞参加6-HDA诱导多巴胺能神经元损伤模型，用4-甲基偶氮唑蓝TT检测P12细胞活力；流式细胞仪F测定P12细胞凋亡百分比；采用免疫印迹法检测Bl-2和Bax的表达程度。结果100l/L的6-HDA处理P12细胞24h，细胞活力较正常对照组明显降低(P0.01)；与模型组比拟，GBE20，40g/l可明显减轻6-HDA对

2、P12细胞的毒性，GBE可使细胞活性增强，降低凋亡百分比。与正常对照组比拟，模型组Bax表达升高，而Bl-2表达降低(P0.05)。与模型组比拟，GBE各剂量组Bax降低，而Bl-2升高，且呈剂量依赖性(P0.05)。结论GBE对6-HDA诱导的P12细胞凋亡具有抑制作用，上调Bl-2和下调Bax表达可能是其作用的机制之一。【关键词】银杏叶提取物；P12细胞；6-羟基多巴胺；细胞凋亡Abstrat:bjetiveTinvestigatetheprtetiveeffetandtheausalehanisfGinkgbilbaextrat(GBE)againstP12ellularapptsisi

3、nduedby6-hydrxydpaine(6-HDA).ethdsDpainergineurnalinjurydelasinduedbyadditinf6-HDAintP12ellsulturedinvitrandpretreatedatdifferentnentratinsfGBE.ellviability,appttiperentage,andtheexpressinfBaxandBl-2ereassayedbyTT,Fandiunbltting,respetively.ResultsThelivabilityfP12ellstreatedith100l/L6-HDAfr24hasler

4、thanthatfthentrlgrup(P0.01).parediththe6-HDAgrup,GBEatnentratinsf20and40g/luldarkedlyrelievethetxiityf6-HDAnP12ells,hihsuggestedthatGBEuldinreasetheellularativityanddereasetheperentagefellularapptsis.TheBaxexpressinasup-regulatedin6-HDAgrupsandBl-2expressinasdn-regulated(P0.05),parediththentrlgrup.p

5、arediththe6-HDAgrup,theBaxexpressinasdn-regulatedandBl-2expressinasup-regulatedinGBEgrups,inadse-dependentanner(P0.05).Thedifferenehadstatistisignifiane.nlusinsAsneftheausalehaniss,GBEhasinhibitryeffetsntheapptsisfthe6-HDA-induedP12ellsbyup-regulatingBl-2expressinanddn-regulatingBaxexpressin.Keyrds:

6、Ginkgbilbaextrat;P12ells;6-hydrxydpaine;apptsis帕金森病(Parkinsndisease,PD)是一种以黑质纹状体通路的退变为主要特征的神经系统变性疾玻近年来许多根底和临床研究说明，氧化应激反响增强在PD黑质神经元凋亡中起着主要作用，氧自由基去除系统的缺陷在PD发病机制中具有重要的病因学意义，故采用抗氧化治疗正日益成为治疗PD的重要手段1-2。氧化应激损伤涉及到氧化应激和抗氧化系统的失衡，因此，可以通过摄入抗氧化剂限制氧化损伤3。银杏叶提取物Ginkgbilbaextrat,GBE主要含黄酮甙类、萜类和酚类等，具有去除自由基和过氧化脂质、对抗兴奋性

7、神经递质的释放、拮抗血小板活化因子等多种药理活性4，临床已广泛用于心脑血管疾病及老年痴呆症的治疗。但GBE对氧化应激损伤神经元是否有保护作用，报道甚少。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株P12细胞由于其本身的特性常被用作神经元模型。因此，本研究以6-羟基多巴胺(6-hydrxydpaine,6-HDA)损伤P12细胞为氧化应激损伤神经元的模型，讨论GBE对氧化应激损伤神经元的保护作用及其防治PD的可能性。1材料和方法1.1主要试剂GBE为德国威玛舒培博士药厂产品17.5g/5l，6-HDA为Siga公司产品，AnnexinV-FIT凋亡测定试剂盒购自深圳晶美生物工程，胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、4-甲基偶

8、氮唑蓝TT购自美国Ares公司，DE培养基为美国GIB公司产品，新生牛血清、马血清购自杭州四季青生物工程公司，鼠源Bl-2单抗(-2)(N.s-7382)和Bax单抗(B-9)(N.s-7480)购自北京中杉生物技术，BA蛋白浓度测定试剂盒购自北京碧云天生物技术研究所。1.2细胞培养P12细胞购于中科院上海细胞所。培养于含体积分数为5%马血清、10%新生牛血清，1105U/L青霉素、100g/L链霉素及2l/LL-谷氨酰胺的DE培养液中，用NaH3和Hl调pH值至7.07.2完全培养液。于37、5%2条件下培养，每23天换液1次。细胞80%交融时，用0.125%胰蛋白酶消化，13分瓶传代。选取

9、对数生长期细胞进展实验处理。1.3药物处理细胞接种24h后给予处理因素。对照组(NS)：P12细胞正常培养于DE完全培养液中；模型组(6-H)：完全培养液中参加终浓度为100l/L的6-HDA预实验以6-HDA25、50、100、150、200l/L孵育P12细胞6、12、24h和48h后以TT测定细胞存活率，结果选定6-HDA100l/L作用24h作为实验的干预点，其细胞生存率为51.6%；GBE低中高剂量组(GL、G、GH)：GBE终浓度分别为10、20、40g/L，通过预实验确定作用2h后，参加终浓度为100l/L6-HDA的完全培养液。从6-HDA参加起继续培养24h，供检测。1.4T

10、T法检测P12细胞存活率细胞以2107个/L接种于96孔板，培养24h后进展药物处理，按1.3要求分5组。每组设6孔，同时设3孔无细胞空白对照。加药后继续培养24h，终止培养前4h每孔参加TT液20l，置37继续培养4h。弃上清，每孔参加DS150l，振荡10in，终止反响并充分溶解甲臜颗粒，用全自动酶标光度仪进展比色,波长为570n，记录各组的D值D测=D实-D空均，结果以均数标准差表示。各实验组P12细胞活力以各实验组的D值与正常对照组的D值的比值表示。实验重复3次。1.5细胞凋亡检测P12细胞经分组加药处理后，5%2、37培养24h，把细胞培养液分别吸出，PBS洗涤贴壁细胞1次，胰酶消化

11、。消化下来的细胞参加转移的原培养液，混匀，1000r/in心5in，弃上清，PBS重悬并计数。分别取510万个重悬细胞，1000r/in离心5in，弃上清，参加195lAnnexinV-FIT结合液1重悬，参加5lAnnexinV-FIT，混匀。避光孵育10in。1000r/in离心5in，弃上清，参加190lAnnexinV-FIT结合液1重悬，参加10l碘化丙啶染色液，混匀。FASVantageSE型流式细胞仪BetnDikinsn，USA检测细胞凋亡的情况。1.6免疫印迹检测Bl-2、Bax的表达将80%左右交融、状态良好的细胞进展消化，制成细胞悬液2108/L，各取2l参加5个培养瓶，

12、加完全培养液至10l，5%2、37培养至70%左右交融，换含1%新生牛血清的培养液细胞同步化12h后，按分组要求加药继续培养24h。以预温至37的PBS2l洗涤2次，吸干多余PBS。置冰袋上，各参加细胞裂解液300l，铺满细胞生长面，裂解20in，搜集细胞于1.5lEP管，4000r/in离心10in，移上清于新EP管，得细胞处理液。按BA蛋白测定试剂盒测定蛋白质量含量。将所有蛋白样品调至等浓度，加1ladingbuffer溶解后直接上样，剩余溶液低温储存(-701个月，-201周，412天)，每次上样前98，5in。按80g/孔上样，经12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳别离，以半干转法转移

13、至N膜。经3%BSA封闭3h，参加按1300体积比稀释的Bl-2、Bax鼠源单克隆抗体，4过夜。用洗涤液洗膜，参加相应11000体积比稀释的二抗兔抗鼠，37反响2h。洗膜3次，以NBT/BIP显色，水洗终止反响。-atin以一样方法检测。结果以Quantityne图像处理仪Bi-Rad公司,USA处理，进展光密度(D)分析，蛋白表达的变化以实验组中相应条带的D值相对于-atin的倍数表示。1.7统计学处理计量资料用s表示，用SPSS13.0统计软件进展分析。多组间差异的显著性分析用单因素方差分析，组间两两比拟方差齐用SNK检验。检验水准：=0.05。2结果2.1P12细胞活力的变化与正常对照组

14、NS相比，模型组6-HP12细胞的活力显著下降P0.01，提示6-HDA对细胞有损伤作用。GBE低中高浓度给药后，相对于模型组，P12细胞的活力逐渐进步(P0.05)，这种改变呈剂量依赖性，提示GBE在一定范围内对P12细胞损伤具有保护作用(表1,图1)。表1GBE对细胞活力和细胞凋亡率的影响略NS:正常对照组；6-H:模型组；GL，G，GH：GBE低、中、高剂量组。与正常对照组比拟：P0.05；与模型组比拟：fP0.05图1流式细胞仪检测P12细胞凋亡略各图左上角为凋亡细胞，左下角为正常细胞，右上角为坏死细胞2.2P12细胞凋亡百分比的变化与正常对照组相比，模型组P12细胞的凋亡百分比显著增

15、高P0.01，提示6-HDA能诱发P12细胞凋亡。相对于模型组，GBE各剂量组的细胞凋亡百分比均有显著降低P0.05。说明GBE可以明显降低6-HDA诱发的P12细胞凋亡(见表1,图1)。2.3GBE对Bl-2和Bax表达的影响Bl-2是重要的抗凋亡基因，而Bax那么是重要的促凋亡基因。模型组Bl-2的表达显著降低，而Bax的表达那么显著增加，Bax/Bl-2的比值显著进步，与正常对照组相比有统计学意义P0.05。与模型组相比，GBE各剂量组Bl-2的表达逐渐增加，Bax的表达那么逐渐减少，Bax/Bl-2的比值也逐渐降低且呈剂量依赖性P0.05图2。图2免疫印迹法测定GBE对Bax和Bl-2

16、表达的影响略A：免疫印迹法结果，-atin为内参；B：比色结果。与正常组比拟：P0.01;与模型组比拟：fP0.05转贴于论文联盟.ll.3讨论PD的主要病理变化是中脑黑质和黑质纹状体通路DA神经元的变化和缺失。目前，人们对PD发病机制仍未明确，但越来越多的研究说明选择性DA神经元损伤和丧失与神经元凋亡亲密相关5-6，出现PD病症的患者其脑内DA能细胞80%以上发生凋亡7。Tang等8研究认为各种病因可经由细胞凋亡这一条共同途径而导致PD发病，凋亡是导致PD神经元变性的基矗P12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，它能表达酪氨酸羟化酶并且合成多巴胺，因此也被称为DA能细胞。6-HDA是一种神经毒素

17、，由于构造与DA类似，可被摄入到DA能神经元内，通过形成羟自由基和抑制线粒体氧化呼吸链复合物和，干扰ATP合成，选择性引起DA能神经元死亡9。所以，本实验采用6-HDA诱导P12细胞Bax和Bl-2表达，从细胞程度讨论GBE对PD的治疗作用及可能的机制。结果显示，6-HDA可以诱导P12细胞凋亡，使细胞存活率降低，成功建立了6-HDA诱导的细胞损伤的PD模型，并通过GBE的干预，采用免疫印迹法检测了Bl-2和Bax表达的变化。与正常对照组比拟，6-HDA处理组Bl-2表达降低，Bax表达升高，而银杏叶提取物对Bl-2表达降低和Bax表达升高具有抑制作用。正常情况下，多巴胺能神经元的凋亡受细胞内

18、基因抑制细胞凋亡基因、促细胞凋亡基因和在细胞凋亡过程中起协助作用的基因和细胞外因素的共同调节。促凋亡和抗凋亡的Bl-2类蛋白的比例可以调节线粒体死亡信号通路，在氧化应激环境下有利于凋亡的发生。其中Bl-2是重要的抗凋亡基因，Bax那么是重要的促凋亡基因，与Bl-2基因有21%的同源性。Bax/Bl-2的增高改变了线粒体的完好性，引起凋亡特定蛋白如yt，凋亡诱发因子等的释放，进而导致aspase-9的活化，最终活化aspase-3导致细胞凋亡。GBE是具有多种药理活性的中药制剂，目前临床已广泛用于老年痴呆的治疗。有实验10显示GBE能防止黑质细胞损伤，对大鼠PD的发病有一定的预防和治疗作用，为临

19、床用于PD防治提供了实验根据。另一实验研究证明,GBE可以降低左旋多巴的神经毒性，和左旋多巴合用治疗PD是个可行的方法，而且效果比单独使用左旋多巴更好11。本实验采用不同剂量的GBE作用于P12细胞，免疫印迹方法观察JNK介导的非核通路中的Bl-2与Bax的变化，发现GBE可以增加P12细胞Bl-2的表达并抑制Bax的表达，且具有一定的剂量依赖性。初步提示GBE可能对PD有一定的治疗作用，其机制可能与阻断神经元的非核通路有关。然而，GBE是药理作用非常广泛的中药制剂，其对于神经元凋亡的预防是主要通过抗氧化作用，还是另有其他途径？GBE的抗凋亡作用是否只是其神经保护作用的一个方面？还有待于进一步

20、深化研究。【参考文献】1lan,JankviJ.NeurprtetivetherapyinParkinsnsdiseaseandtrpliatins:Asearhfrapathgenesis-targeted,disease-difyingstrategyJ.vDisrd,2022,20(S11):S3-S10.2BradburyJ.Nehpefrehanis-basedtreatentfParkinsnsdiseaseJ.DrugDisvTday,2022,10(2):80-81.3nyangIG.ithndrialdysfuntinandxidativestressinParkinsnsd

21、iseaseJ.NeurheRes，2022,33(3):589-597.4YshikaaT,NaitY,Knd.Ginkgbilbaleafextrat:ReviefbilgialatinsandlinialappliatinsJ.AntixidRedxSignal,1999,1(4):469-480.5KarunakaranS,DiakarL,SaeedU,etal.Ativatinfapptsissignalregulatingkinase1(ASK1)andtranslatinfdeath-assiatedprtEin,Daxx,insubstantianigraparspatainausedelfParkinsnsdisease:prtetinbyalpha-lipiaidJ.FASEBJ,2022,21(9):2226-2236.6angDQ,ang,JingF,etal.EstablishentfthexidativedaagedelinbrainfPDratsinduedbyL-DPAithir-dialysistehniqueJ.hinPharalBull,2022,2