永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究

1、永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的别离纯化及其降糖活性研究【关键词】豆豉；,胰蛋白酶抑制剂；,别离纯化；,降糖作用摘要：目的从豆豉中提取胰蛋白酶抑制剂，并讨论其降血糖活性。方法以永川豆豉为材料，经脱脂，酸性溶液提取，硫酸铵沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物，再经SephadexG-75凝胶层析得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，以纯化的胰蛋白酶抑制剂给糖尿病小鼠灌胃并观察其降血糖活性。结果从豆豉里别离出的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率为30%40%；用抑制剂提取液给四氧嘧啶糖尿病模型小鼠连续灌胃4d，发现其血糖值明显低于模型组；观察小鼠的胰组织病理切片，与糖尿病小鼠比拟，灌胃后的小鼠胰组织明显得到修复。结论豆豉提取液

2、有较明显的降糖作用。关键词：豆豉；胰蛋白酶抑制剂；别离纯化；降糖作用PurifiatinATrypsinInhibitrfrLbsterSauePrduedinYnghuanandHypglyeiAtinfResearhAbstrat：bjetiveTislateandpurifythetrypsininhibitrfrLbstersaueandinvestigateitshypglyeiatin.ethdsAtrypsininhibitraspurifiedfrthelbstersauefYnghuanbydefatting，extratinithaxidibuffer，preipitati

3、n，hratgraphynSephadexG-75，anditshypglyeiatininieasstudied.ResultsAseriesstudynlbstersaueshedthattheinhibitrhadinhibitinativityfthirtyfrtyperentttrypsin.Inesxalylarbaidedel，thebldgluselevelserereduedafterfurdaystreatedithlbstersaueextratsfYnghuan,parediththedelgrup.nlusinThetrypsininhibitrhashypglyei

4、atin.Keyrds：Lbstersaae；Trypsininhibitr；Islatinandpurifiatin；Hypglyeiatin蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物和微生物中，具有抑制蛋白酶的活性的作用，能与相应的蛋白酶水解，参与体内许多重要生理过程的调节。其中胰蛋白酶抑制剂具有重要的药用价值，对于急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效1。蛋白酶抑制剂被认为是植物天然的自我防御体系，是植物抗病基因工程的重要目的基因来源2。大豆胰蛋白酶抑制剂STI与其它临床上广泛应用的胰蛋白酶抑制剂具有相似的性质，但其生理活性研究还没得到足够的重视。和其他胰蛋白酶抑制剂相比，大豆胰蛋白

5、酶抑制剂具有分子量较孝免疫反响较弱、植物来源的抑制剂能防止携带动物病毒、原料来源广、价格低廉等优点，应当得到足够的重视。大豆胰蛋白酶抑制剂的种类有710种，目前研究证明主要有两种在动植物体内能抑制胰蛋白酶活力：一种为鲍曼克抑制剂(BBI),是由71个氨基酸组成的多肽，分子量为7975，分子内有7个二硫键，另一个为库尼兹抑制剂KSTI，分子量约2万，分子内有2个二硫键。近年来国外报道发现低浓度的BBI在动物体内对直肠癌、肝癌等多种癌症有抑制作用；另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果3，但未见有降血糖作用的详尽报道。因此，对具有强抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑

6、制剂，从豆豉中别离纯化，使其成为抗癌、治疗糖尿病及其并发症的新药用于临床，有非常积极的意义。1仪器与材料DS1高速组织捣碎机上海标本模型厂,KD1042离心机科大创新股份中佳分公司，722分光光度仪上海精细科学仪器，AE240电子天平ETTLER公司；雄性昆明种小鼠体重1822g，永川豆豉(市售咸豆豉)，透析袋，牛胰蛋白酶(1250)、BAPNAHl(购自上海维思科贸),Tris(成都化学试剂厂消费)，sephadexG75(上海化学试剂厂消费)，四氧嘧啶(Allxan，Siga公司)，葡萄糖试剂盒GLU氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂，肝素钠天津生物化学制药厂，其它试剂均为国产分析纯。2

7、方法与结果2.1豆豉胰蛋白酶抑制剂的别离纯化2.1.1豆豉胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋白酶抑制剂对热酸环境相对稳定，一般采用水浸酸提、沉淀再经离子交换或凝胶层析纯化制得。取2kg永川豆豉，于46恒温枯燥9h,枯燥后置于干净托盘中,把枯燥豆豉粉碎、称重，然后参加去离子水2L，于0提取15h。15h后于3000r/in离心6in,沉淀弃去,搜集上清液。取上清液，参加正己烷正己烷上清液(12)，静置30in,后用1000l的分液漏斗别离上述混合液,回收正己烷,搜集棕色豆豉提取液。用稀盐酸20%(v/v)调豆豉提取液的pH约为

8、4，于55水浴中保温1h。称取固体硫酸铵，分次少量参加于水浴的上清液里，使硫酸铵的饱和度为30%，继续于55的水浴恒温15in，离心15in3800r/in，弃去沉淀，留上清液。在上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵的饱和度为55%，55保温10in，再离心15in，弃去沉淀，搜集上清液。再于上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵溶液的饱和度为70%，55恒温10in，离心30in12000r/in，弃去上清液，搜集沉淀，用20l磷酸盐缓冲液pH7.8溶解沉淀,沉淀即为抑制剂粗提物4，于4保存在冰箱里。2.1.2抑制剂粗提物的透析将抑制剂粗提物置于透析袋中蒸馏水充分透析7d，除去盐分。2.1.3凝胶柱的制备

9、及抑制剂粗提物的纯化5取层析柱1660)洗干净并烘干。称取12.5gsephadexG75溶解在250l0.05lL-1pH7.8的磷酸缓冲液中，充分混匀后，在100水浴中蒸煮5h，赶走气泡，将凝胶连续沿壁缓缓倒入层析柱中，待有2沉淀后，翻开柱子下端的出口。稳定以后在凝胶的上缘留23缓冲液，并放一个面积相当的滤纸片，吸出存留缓冲液，参加5l样品，连上缓冲液，翻开出口阀，控制流速在2l/h。流出30l后，用干净的试管分部搜集23l，检测每管的抑制剂活性。2.1.4BAPNA法测定胰蛋白酶抑制剂活性参考文献6略加改良，取不同胰蛋白酶抑制剂制备物并与0.2l胰蛋白酶溶液0.1g/l混合，于5lTri

10、sHl缓冲液pH8.0，0.05lL-1中37保温5in，参加BAPNA2.5l5lL-1，于37恒温10in，立即参加0.5l33%醋酸溶液终止反响，以不加抑制剂的试样做对照，410n处测定吸光度值。每降低0.1个A410n为一个BTI抑制活性单位U。转贴于论文联盟.ll.图1豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率略由图1可看到纯化过的豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制作用是较强的，是一种抑制力较强的抑制剂。2.2抑制剂提取物对小鼠血糖程度的影响2.2.1实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立取雄性昆明种小鼠体重1822g，随机分为3组。每组10只，分别为正常对照组、四氧嘧啶高血糖模型组、抑制剂提

11、取物灌胃组。高血糖模型组及高血糖模型灌胃组禁食10h。按200l/kg的用量，腹腔注射四氧嘧啶。72h后人工断尾取血，选取空腹血糖值大于11.0lL-1的小鼠作为高血糖模型小鼠。2.2.2豆豉胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖程度的影响高血糖模型灌胃组按每天0.3l/只用量经口服灌胃给药4d。正常组和高血糖模型组每天注射等剂量的生理盐水。每日观察小鼠皮毛、活动等生长情况。末次给药后，所有动物禁食10h，按试剂盒方法测定血糖值。表1豆豉胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖程度的影响略P0.001由表1可见，第1天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型组有所降低，第4天灌胃后的小鼠血糖值比高

12、血糖模型组明显降低，说明豆豉胰蛋白酶抑制剂提取物有较明显的降血糖作用。2.2.3豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰组织的影响处死小鼠，分别取四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃前后的胰腺组织做病理切片HE染色，显微镜下观察，结果如图23。由图23可见，四氧嘧啶高血糖模型小鼠胰组织严重病变，灌胃后小鼠胰组织形态好于四氧嘧啶高血糖模型组织，胰岛构造较明晰，边缘与周围腺胞界限明显。说明豆豉胰蛋白酶抑制剂提取液对胰岛组织有明显的修复作用。图2抑制剂灌胃后小鼠胰组织略图3四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰组织略3讨论据报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调有一定效果。我们在实验中观察到豆豉胰蛋白酶抑制剂提取液有降低

13、四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的作用。我们尚在本实验中做了豆豉胰蛋白酶抑制剂对-葡萄糖苷酶活性抑制实验，结果显示无抑制活性作用。提示其降糖机理可能不是通过影响胰岛素受体后糖代谢的环节，而可能是通过保护或修复胰岛细胞及胰岛组织促进胰岛素分泌或释放起作用的7。可能是豆豉提取液中胰蛋白酶抑制剂对胰腺产生了一定作用，促进胰岛素的释放，从而降低了血液中葡萄糖的浓度，但降糖作用机理尚有待再进一步分析研究。参考文献：1康庄，王竞，张年辉，等.菠菜种子胰蛋白酶胰制剂得别离纯化与局部性质研究J.天然产物研究与开发，2022，172：143.2曾英，蔡玉英，胡金勇，等.波叶青牛胆胰蛋白酶抑制剂的纯化及局部性质研究J.云南植物研究，2002，241：103.3KennedyAnnR.TheevidenefrsybeanprdutsasanerpreventiveAgentsJ.ThejurnalfNutritin,1995,125：7335.4陈星，刘蕾，刘辉.固定化酶法别离纯化大豆胰蛋白酶抑制剂J.食品