FBXO40对心肌细胞增殖的作用

1、PAGE PAGE - 12 -FBXO40对心肌细胞增殖的作用谢敬仪王琪王涛钱丽丽摘要目的探究E3泛素連接酶FBXO40在心肌细胞增殖过程中的调控作用。方法转染si-FBXO40小干扰RNA和FBXO40过表达载体分别敲低和过表达原代心肌细胞中的FBXO40，利用实时定量PCR（qPCR）方法检测经上述处理后原代心肌细胞中增殖相关标记基因（cdc20、Cyr61、Ccna2、Aurkb）的表达水平;转染FBXO40过表达载体以及si-FBXO40小干扰RNA，在24h后利用CCK-8方法进一步检测原代心肌细胞增殖情况。结果与对照组相比，过表达FBXO40的原代心肌细胞中与细胞增殖相关基因Cc

2、na2、Cdc20、Aurkb和Cyr61的表达明显上调，差异具有统计学意义（t=2.203.90，P0.05）。与对照组相比，敲低FBXO40表达的原代心肌细胞中促增殖基因Cyr61的表达明显下降，差异有统计学意义（t=10.96，P0.05）。CCK-8检测显示，FBXO40过表达组的吸光度值高于对照组，敲低组的吸光度值低于对照组，差异有统计学意义（F=6.72，P0.05）。结论FBXO40在心肌细胞增殖过程中具有重要的调控作用，可促进心肌细胞增殖。关键词泛素蛋白连接酶类;FBXO40;肌细胞，心脏;细胞增殖中图分类号R345.9;R329.25文献标志码A文章编号2096-5532（2

3、022）02-0201-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.047开放科学（资源服务）标识码（OSID）网络出版https：/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1333.003.html;2022-03-1415：16：03EFFECTOFFBXO40ONTHEPROLIFERATIONOFCARDIOMYOCYTESXIEJingyi，WANGQi，WANGTao，QIANLili（InstituteofTranslationalMedicine，QingdaoUniversityMeadicalCollege，Qingdao

4、266021，China）ABSTRACTObjectiveToinvestigatetheregulatoryroleoftheE3ubiquitinligaseFBXO40intheprocessofcardiomyocyteproliferation.MethodsPrimarycardiomyocytesweretransfectedwithsi-FBXO40small-interferingRNAorFBXO40overexpressionvectortoknockdownFBXO40orinducetheoverexpressionofFBXO40.Quantitativereal

5、-timePCRwasusedtomea-surethemRNAexpressionlevelsofproliferation-relatedmarkers（Cdc20，Cyr61，Ccna2，andAurkb）intheprimarycardiomyocytesaftertheabovetreatment，andCCK-8assaywasusedtomeasuretheproliferationofprimarycardiomyocytesat24hoursaftertransfectionwithFBXO40overexpressionvectororsi-FBXO40small-inte

6、rferingRNA.ResultsComparedwiththecontrolgroup，theprimarycardiomyocyteswithFBXO40overexpressionhadsignificantincreasesintheexpressionofproliferation-relatedgenes（Ccna2，Cdc20，Aurkb，andCyr61）（t=2.20-3.90，P0.05），whiletheprimarycardiomyocyteswithFBXO40knock-downhadasignificantreductionintheexpressionofth

7、eproliferation-promotinggeneCyr61（t=10.96，P0.05）.CCK-8assayshowedthatcomparedwiththecontrolgroup，theFBXO40overexpressiongrouphadasignificantlyhigherabsorbancevalueandtheFBXO40knock-downgrouphadasignificantlylowerabsorbancevalue（F=6.72，P0.05）.ConclusionFBXO40playsanimportantroleinregulatingtheprolife

8、rationofcardiomyocytesandcanpromotetheproliferationofcardiomyocytes.KEYWORDSubiquitin-proteinligases;FBXO40;myocytes，cardiac;cellproliferation严格的蛋白质控制在心脏的发育与功能维持方面发挥重要作用，蛋白质代谢或运输异常存在于多种心脏疾病中。泛素蛋白酶体系统在调控错误折叠蛋白或损伤蛋白降解方面发挥重要作用，其中，E3泛素连接酶尤为重要，它通过对细胞关键蛋白的识别、相互作用和泛素化，在细胞增殖和分化等过程中发挥着关键作用1。近年来大量研究发现，泛素连接酶参与

9、细胞增殖的调控，细胞周期调节因子（其中许多具有肿瘤抑制或致癌功能）的破坏与癌症的发生进展密切相关;癌抑制蛋白的非正常或快速降解，或者是癌蛋白的大量堆积，都会导致癌细胞的增殖和转化。2022年，NAKAYAMA等2发现，Skp1-Cul1-F-box（SCF）E3泛素连接酶复合体的特异性泛素化导致细胞增殖、基因组不稳定甚至是癌症。2022年，LIU等3研究表明，泛素蛋白酶FAT10可调控癌细胞的增殖。2022年，GUO等4研究表明，泛素蛋白酶HRD1在谷氨酰胺缺乏的条件下可特异性抑制三阴性乳癌细胞增殖。F-box蛋白是E3泛素连接酶的一种，FBXO40是2022年发现的一种F-box蛋白，其在骨

10、骼肌和心肌中特异性高表达，而且在去神经性肌肉萎缩样本中的表达也显著上调5。2022年SHI等6研究结果表明，SCF-FBXO40复合体在骨骼肌中通过诱导胰岛素受体底物1（IRS1）蛋白降解来抑制胰岛素样生长因子1（IGF1）诱导的骨骼肌肥大信号通路。然而，FBXO40在心肌中的研究尚未见报道。本研究旨在探讨FBXO40对心肌细胞增殖是否具有调控作用以及发挥怎样的作用，以期为心肌疾病的治疗提供新的思路。1材料与方法1.1主要材料DMEM-F12培养液、PBS缓冲液（美伦生物公司），胎牛血清（BI公司），Trizol总RNA提取试剂、M-MLV逆转录试剂盒、SYBRGreen预混型实时定量PCR（

11、qPCR）试剂盒（艾瑞克生物公司），胰液素（美国Sigma公司），型胶原酶（美国Worthington公司），DEPC原液、qPCR引物（擎科生物公司），siRNA序列及NC对照序列（上海吉玛生物科技有限公司），Lipofectamine3000转染试剂（美国Invitrogen公司），CCK-8试剂盒（同仁化学研究所）。1.2实验方法1.2.1原代心肌细胞培养解剖大鼠乳鼠取出心脏，在PBS缓冲液中洗涤至无血污;将心脏剪碎后置于含有胰液素和胶原酶的消化工作液中（用PBS液加到50mL），在37恒温水浴锅中消化68min，收集每次消化后的上清液，剩余组织加入5mL消化液继续消化，直至组织块被完全

12、消化;将上清液收集到离心管中以8001000r/min离心56min，弃上清，将沉淀的细胞加入DMEM-F12培养液（加青霉素/链霉素双抗）中吹打混匀清洗后，再次离心去上清，将剩余沉淀再次悬浮于DMEM-F12培养液（加青霉素/链霉素双抗）中，经260目过滤网过滤到培养皿，在37细胞培养箱中差速贴壁培养1.52.0h，最后接种于细胞培养皿中。整个过程在超净工作台中进行无菌操作。1.2.2细胞转染当原代心肌细胞密度达60%70%时可进行转染。实验分为对照组、敲低组和过表达组。对照组细胞不做处理。敲低组先将溶解的3.5Lsi-FBXO40小干扰RNA加入到125L无血清DMEM-F12培养液中混匀

13、（标为1号管），过表达组则先将2.5L的FBXO40过表达载体加入到125L无血清DMEM-F12培养液中混匀（2号管），置室温35min;将7LLipofectamin3000加入250L无血清DMEM-F12培养液中混匀（3号管），室温放置35min;将3号管中试剂按11的比例分入1号、2号管中混匀，室温下静置2025min;敲低组和过表达组分别将1号、2号管中液体加入到细胞培养皿中，于37恒温培养箱培养24h，进行后续检测。1.2.3qPCR检测增殖相关基因的表达用Trizol试剂提取原代心肌细胞总RNA，测定RNA浓度及纯度，进行反转录和qPCR。模板cDNA使用逆转录试剂盒构建，qP

14、CR体系根据试剂盒说明书设置。引物序列见表1。将qPCR的定量结果标准化，以GAPDH为内参对照，计算Cdc20、Ccna2、Cyr61和Aurkb基因的相对表达量。实验至少重复3次。1.2.4CCK-8法检测细胞增殖将原代心肌细胞悬液接种于96孔板中（每孔约1104个细胞），分为对照组、敲低组和过表达组，每组设置5个复孔，各组细胞的处理同1.2.2。细胞培养24h后进行CCK-8检测，每孔加入10LCCK-8溶液，37孵育2h后，用酶标仪测量450nm波长处的吸光度值。实验重复3次7。1.3统计学分析使用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析。计量资料数据以xs表示，两组比较采用

15、成组t检验，多组比较采用方差分析。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1过表达FBXO40后心肌细胞中增殖相关基因的表达变化qPCR检测结果显示，过表达组细胞成功诱导FBXO40过表达（t=45.22，P0.01）;与对照组相比较，过表达组原代心肌细胞中与细胞增殖相關基因Ccna2、Cdc20、Aurkb和Cyr61的表达均明显上调（t=2.203.90，P0.05）。见表2。2.2敲低FBXO40后心肌细胞中Cyr61基因的表达变化qPCR检测结果显示，敲低组的原代心肌细胞中成功转染si-FBXO40小干扰RNA（t=8.27，P0.05）;与对照组相比，敲低组原代心肌细胞中促增殖基因

16、Cyr61的表达明显下降，差异有统计学意义（t=10.96，P0.05）。见表3。2.3FBXO40對心肌细胞增殖的影响转染24h后CCK-8检测结果显示，对照组、过表达组和敲低组的吸光度值分别为0.1910.005、0.2050.002和0.1540.030（n=3），过表达组的吸光度值高于对照组，敲低组的吸光度值低于对照组，差异有统计学意义（F=6.72，P0.05）。表明敲低FBXO40会抑制原代心肌细胞增殖，而过表达FBXO40能促进细胞增殖。3讨论泛素蛋白酶体系统参与多种细胞过程的调控，如细胞增殖、细胞周期进程、转录和凋亡等8-11。在细胞增殖过程中细胞的有丝分裂周期是一个被严格调控

17、的过程，有丝分裂的进程复杂，需要通过泛素连接酶的复杂催化和蛋白酶复合体对底物的降解来调节细胞周期12。细胞周期调控过程主要是周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的连续性激活，通过CDKs以及周期蛋白激酶抑制剂（CKIs）的泛素介导来实现蛋白质的水解。在真核细胞中，E3泛素连接酶的两个家族，即后期促进复合物和SCF蛋白复合体，负责许多CDKs调节因子的泛素化和蛋白酶体降解，确保细胞周期的精确调控13-14。在过去的几十年里，越来越多的证据表明，由于蛋白水解控制不力而导致的细胞周期转变异常，导致细胞增殖失控，最终影响身体功能甚至是发生癌变15-17。一些泛素化因子通过调控细胞增殖以及细胞周期进程来参与心

18、血管疾病的治疗18。因此，更好地理解细胞增殖，了解细胞周期调控中泛素信号的多样性和复杂性，将为精确控制细胞周期进程和解决癌症或心血管疾病的临床治疗问题提供新的思路。E3泛素连接酶在蛋白质代谢中发挥重要的作用，F-box蛋白作为一种E3泛素连接酶是SCF的重要组成部分，它通过F-box结构域与Skp1相互作用，并通过其他相互作用区域与蛋白结合并使其泛素化进而介导蛋白水解19。F-box蛋白根据其特异性底物识别域可分为3个亚类：FBXW亚类含有WD40重复结构域，由10个成员组成;FBXL亚类富含亮氨酸重复结构域，有22个家族成员;其余37种F-box蛋白被指定为FBXO蛋白，其中包含各种尚未被完

19、全鉴定的结构域20-23。FBXO40蛋白是2022年发现的一种F-box蛋白。已经有研究发现，FBXO40在骨骼肌和心肌中特异性高表达5，然而FBXO40在心肌中的作用未见报道。本研究通过体外实验，初步探究了FBXO40在心肌细胞增殖过程中是否具有调控作用，以及具有怎样的调控作用。本研究首先采用qPCR方法检测过表达FBXO40后原代心肌细胞中增殖相关基因的表达变化，结果显示，在原代心肌细胞中过表达FBXO40后，与细胞增殖相关的基因Ccna2、Cdc20、Aurkb、Cyr61的表达均显著上调，提示FBXO40具有促进心肌细胞增殖的作用。随后，本研究又通过敲低原代心肌细胞中的FBXO40表

20、达，分别采用qPCR和CCK-8方法检测了具有促增殖作用的基因Cyr61相对表达量的变化以及细胞增殖情况，结果显示，与过表达FBXO40相反，敲低FBXO40表现出抑制细胞增殖的作用，进一步验证了FBXO40对细胞增殖具有促进作用。在后续工作中我们将进一步探究FBXO40在心肌细胞增殖中的具体调控通路，为心血管疾病的预防治疗提供新的靶标。参考文献1DENGL，MENGT，CHENL，etal.TheroleofubiquitinationintumorigenesisandtargeteddrugdiscoveryJ.SignalTransductionandTargetedTherapy，2

21、022，5（1）：11.2NAKAYAMAKI，NAKAYAMAK.Ubiquitinligases：cell-cyclecontrolandcancerJ.NatureReviewsCancer，2022，6（5）：369-381.3LIUXX，CHENLF，GEJ，etal.Theubiquitin-likeproteinFAT10stabilizeseEF1A1expressiontopromotetumorproli-ferationinacomplexmannerJ.CancerResearch，2022，76（16）：4897-4907.4GUOX，WANGA，WANGW，etal

22、.HRD1inhibitsfattyacidoxidationandtumorigenesisbyubiquitinatingCPT2intriple-negativebreastcancerJ.MolecularOncology，2022，15（2）：642-656.5YEJW，ZHANGY，XUJL，etal.FBXO40，ageneencodinganovelmuscle-specificF-boxprotein，isupregulatedindenervation-relatedmuscleatrophyJ.Gene，2022，404（1/2）：53-60.6SHIJ，LUOLQ，EA

23、SHJ，etal.TheSCF-Fbxo40complexinducesIRS1ubiquitinationinskeletalmuscle，limitingIGF1signalingJ.DevelopmentalCell，2022，21（5）：835-847.7SARRIE，RAMOSB，SALIDOGM，etal.ThecholecystokininanaloguesJMV-180andCCK-8stimulatephospholipaseCthroughthesamebindingsiteofCCK（A）receptorinratpancreaticaciniJ.BritishJourn

24、alofPharmacology，2022，133（8）：1227-1234.8ZOUTT，LINZH.TheinvolvementofubiquitinationmachineryincellcycleregulationandcancerprogressionJ.InternationalJournalofMolecularSciences，2022，22（11）：5754.9TIWARIS，ROELC，WILLSR，etal.EarlyandlateG1/Scyclinsandcdksactcomplementarilytoenhanceauthentichuman-cellprolif

25、erationandexpansionJ.Diabetes，2022，64（10）：3485-3498.10BUDHIDARMOR，DAYCL.Theubiquitin-associateddomainofcellularinhibitorofapoptosisproteinsfacilitatesubi-quitylationJ.TheJournalofBiologicalChemistry，2022，289（37）：25721-25736.11EEG，LEHMINGN.Howtheubiquitinproteasomesystemregulatestheregulatorsoftransc

26、riptionJ.Transcription，2022，3（5）：235-239.12SWATEKKN，KOMANDERD.UbiquitinmodificationsJ.CellResearch，2022，26（4）：399-422.13WOODDJ，ENDICOTTJA.StructuralinsightsintothefunctionaldiversityoftheCDK-cyclinfamilyJ.OpenBiology，2022，8（9）：180112.14SURYADINATAR，SADOWSKIM，SARCEVICB.Controlofcellcycleprogressionby

27、phosphorylationofcyclin-depen-dentkinase（CDK）substratesJ.BioscienceReports，2022，30（4）：243-255.15TAKAHASHIH，UEMATSUA，YAMANAKAS，etal.Establishmentofawheatcell-freesynthesizedproteinarraycontaining250humanandmouseE3ubiquitinligasestoidentifynovelinteractionbetweenE3ligasesandsubstrateproteinsJ.PLoSOne，

28、2022，11（6）：e0156718.16TUNDOGR，SBARDELLAD，SANTOROAM，etal.Theproteasomeasadruggabletargetwithmultipletherapeuticpotentialities：cuttingandnon-cuttingedgesJ.PharmacologyTherapeutics，2022，213：107579.17SENFTD，QIJF，RONAIZA.Ubiquitinligasesinoncoge-nictransformationandcancertherapyJ.NatureReviewsCancer，2022，18（2）：69-88.18DREWSO，TAEGTMEYERH.Targetingtheubiquitin-prot