白花蛇舌草对宫颈癌Hela细胞周期、凋亡及端粒酶活性的影响

1、白花蛇舌草对宫颈癌Hela细胞周期、凋亡及端粒酶活性的影响【摘要】目的研究中药白花蛇舌草Hedytidiffusa，HD对人宫颈癌Hela细胞端粒酶活性、细胞周期及凋亡的影响，以讨论HD抑制Hela细胞肿瘤活性与端粒酶的关系。方法分别以不同的药物浓度作用于体外培养的Hela细胞，用PR-TRAP-ELISA方法定量检测HD处理Hela细胞后其端粒酶活性程度，同步采用流式细胞仪检测细胞周期的变化及凋亡率。结果Hela细胞端粒酶呈阳性，一定浓度的HD作用于Hela细胞一定时间后可使Hela细胞阻滞于S期，并可诱导其凋亡，而端粒酶活性明显降低。结论HD可能通过改变Hela细胞周期分布S期阻滞并同时诱

2、导细胞凋亡，下调其端粒酶活性而到达抗肿瘤作用。【关键词】白花蛇舌草；宫颈癌Hela细胞；细胞周期；凋亡；端粒酶近年来一些学者对白花蛇舌草Hedytidiffusa，HD的抗肿瘤作用进展了研究，其抗肿瘤作用根本得以肯定1-4，但对其作用机制尤其是分子生物学机制认识不深化。端粒酶的表达和细胞凋亡在肿瘤的发生和开展中起重要的作用，如何诱导肿瘤细胞凋亡和调节端粒酶的活性已成为肿瘤治疗的一条新途径。HD具有明显的体内外抗肿瘤作用，这种作用是否与引起肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞和端粒酶活性抑制有关，目前文献报道不多。本研究以人宫颈癌Hela细胞为研究对象，用PR产物的聚丙烯酰胺电泳及银染定性检测端粒酶活性，

3、PR-TRAP-ELISA方法定量检测HD处理Hela细胞后其端粒酶活性程度变化，同步采用流式细胞仪检测细胞周期的变化及凋亡率，以讨论HD抗肿瘤作用机制。1材料和方法1.1材料1.1.1Hela细胞培养Hela细胞由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供，培养液为含10%胎牛血清、100103U/L青霉素、0.1g/L链霉素的RPI1640，用100l培养瓶，置5%2、37、饱和湿度的恒温箱中培养，细胞达80%90%交融状态时用0.25%胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存，全部实验均用指数生长期细胞。1.1.2试剂胎牛血清(天津血液研究所)，胰蛋白酶、核糖核酸酶(RNase)、碘化丙啶PI、PR

4、-TRAP-ELISA端粒酶活性检测试剂盒均购自华美生物工程公司。1.1.3药物HD(江西天师中药集团余江制药厂)200g加蒸馏水2000l温火煎煮60in，加热沸腾30in，网筛过滤去渣，滤液离心20in，取上清液浓缩为200l，0.22过滤除菌，获1kg/LHD提取液备用。1.2实验方法1.2.1药物处理0.25%胰酶消化后,用RPI1640培养液调细胞密度为1108个/L，每培养瓶各加1l，再各参加培养液6l，置5%2、37恒温培养箱中培养，待细胞生长达70%交融时更换培养液同时参加HD提取液，使药物终浓度为20、40、80g/L，不同浓度培养一样时间。设参加等量培养液者为实验对照组。1

5、.2.2流式细胞仪(F)分析Hela细胞周期和凋亡搜集上述处理后的包括贴壁和悬浮的Hela细胞，用PBS调细胞密度为1109个/L，取1l单细胞悬液，离心、漂洗，70%乙醇1l固定细胞，再用PBS漂洗，在单细胞样本中参加RNase，再参加终浓度为50g/L的PI染色，过滤后用F测定。以正常人的外周血淋巴细胞为正常二倍体标准，根据测定的DNA组方图，用ELLQUEST分析软件分析Hela细胞的细胞周期和凋亡指数。1.2.3端粒酶活性检测1.2.3.1Bradfrd法测定细胞提取液蛋白浓度制作Bradfrd法蛋白含量与光密度的标准曲线，根据波长595n下所测样品光密度D，从标准蛋白曲线上读出样品提

6、取液蛋白浓度。1.2.3.2PR-TRAP银染定性检测取20lPR产物混合物参加4l型凝胶上样缓冲液，同时设置端粒酶活性阳性及阴性对照，上样于12.5%聚丙烯酰胺凝胶上进展电泳别离。将凝胶置于银染固定液中轻轻振荡30in，水洗23次后将凝胶移入0.2%硝酸银染色液中，再将凝胶转入显色液3%氢氧化钠、0.3%甲醛中，直到棕黄色条带出现，置于5%乙酸终止液中，最后将凝胶放在保存液10%甘油、2%乙醇中浸泡60in，UVP系统分析打印或干胶保存。1.2.3.3PR-TRAP-ILISA法定量检测取TRAPTubes，各参加TRAPix45l、细胞提取液2.0l(蛋白含量0.510g)，混匀，上覆盖P

7、araffinliquid30l，离心数秒，置25水浴中保温30in,行PR扩增。取PR产物25l，参加HybReagentA25l，混匀后，分别取25l参加到各孔中，混匀，设置端粒酶活性阳性及阴性对照，置37水浴中恒温反响60in。每孔参加hrgenA、hrgenB各50l，37避光反响10in，参加StpSlutin100l，终止反响。酶标仪上波长450n下读取D值。样品D值大于或等于阴性对照D值的2.1倍时端粒酶活性为阳性。1.3统计学处理应用SPSS6.0统计软件进展统计分析，计量数据采用s表示，组间差异采用t检验，检验水准=0.05。2结果2.1HD对Hela细胞周期和细胞凋亡的影响

8、随不同浓度HD提取液作用时间延长Hela细胞凋亡增多，G0/G1细胞明显下降，S期细胞明显增多，而G2/细胞无明显变化。结果见表1。表1流式细胞仪检测HD作用48hHela细胞周期和凋亡的结果(略)2.2HD对Hela细胞株端粒酶活性的影响2.2.1PR-TRAP银染检测结果Hela细胞株端粒酶表达阳性，为银染后出现6bp间隔的棕黄色条带,80g/L浓度HD作用48h后Hela细胞端粒酶仍呈阳性，但从电泳图上判断其活性下降。见图1。转贴于论文联盟.ll.2.2.2PR-TRAP-ELISA定量检测结果20、40、80g/LHD作用48h后，端粒酶活性均有所下降。20g/L的HD作用后，各时点与

9、实验对照组比拟均无显著性差异P0.05；40g/L和80g/L的HD作用于Hela细胞48h后端粒酶活性明显下降，与实验对照组比拟有显著性差异P0.01。见图2。比照PR-TRAP银染检测结果，定量检测D值越高银染结果的条带数量越多、明晰度越高。3讨论近年来在植物中寻找有效且副作用小的抗肿瘤药物已成为国内外重要的课题，关于中药抗肿瘤机制的研究方兴未艾。HD主要的化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、HD素等，研究结果显示HD具有一定的抗肿瘤活性，在体外对多种肿瘤细胞株具有增殖抑制作用2-4。流式细胞仪测到一定浓度的HD作用一定时间后Hela细胞可出现亚二倍体凋亡峰，80g/LHD诱导Hela细胞

10、凋亡率达21.34%，与实验对照组显示的自然凋亡率相比差异显著P0.01。因此认为在一定剂量和时间范围内，HD可抑制Hela细胞生长，诱导Hela细胞凋亡可能是其机制之一。研究说明，细胞增殖和凋亡在恶性肿瘤的发生上亲密相关，阻断细胞增殖周期过程可引起凋亡，而凋亡常伴随有生长抑制，细胞增殖周期与细胞凋亡关系亲密。有学者认为只有G0/G1期细胞才发生凋亡，但更多学者认为细胞周期各时相都可发生凋亡，不同处理因素及不同细胞株凋亡有不同的周期特异性5。细胞增殖需经过G1SG24个时期，任何时相生物合成被阻断均可导致细胞凋亡。本研究通过流式细胞仪对细胞增殖周期进展了分析，结果提示HD能使Hela细胞G0/

11、G1期细胞比例减少，S期细胞比例增多，说明HD使Hela细胞阻滞于S期，S期时相延长到一定时间后丧失增殖才能导致凋亡。这一结果提示临床上使用HD治疗恶性肿瘤的同时，可选用对S期敏感的药物进展结合化疗，进步治疗效果。端粒酶是细胞RNA依赖的DNA聚合酶,能以其自身RNA为模板逆转录合成端粒DNA,对维持端粒长度起重要作用，端粒酶的高表达及防止端粒短缩是促进癌组织克垄繁殖、开展的基矗现已发现人类80%90%的恶性肿瘤可以检测到端粒酶阳性,而大多数正常体细胞不表达端粒酶活性6-8。恶性肿瘤组织中端粒酶的高表达，使其具有更高的抗凋亡才能，一些化学物质诱导肿瘤细胞凋亡可能与其抑制细胞内端粒酶活性有关9-

12、11。据统计，90%以上甚至高达100%的宫颈癌组织中可检测到端粒酶的表达。本实验研究结果说明，一定浓度的HD在其诱导Hela细胞凋亡同时也伴随着端粒酶活性的下降，随着HD浓度升高和作用时间延长Hela细胞端粒酶活性呈下降趋势，而细胞凋亡呈上升趋势。结果提示，HD能下调细胞的端粒酶活性，Hela细胞的凋亡可能与HD下调端粒酶活性有关。深化研究两者的关系有助于进一步认识HD的抗肿瘤机制，并为抑制端粒酶活性诱导凋亡这一治疗恶性肿瘤的新途径提供理论根据，并有利于开发以抑制端粒酶活性和诱导细胞凋亡为靶点的抗肿瘤中药。【参考文献】1单保恩，张金艳，杜肖娜，等.白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性J.中

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