细胞移植修复脊髓损伤的进展

1、细胞移植修复脊髓损伤的进展【关键词】细胞移植修复脊髓损伤的进展脊髓损伤(spinalrdinjury,SI)是脊柱损伤的严重并发症，其治疗一直是临床工作中困扰人们的难题。SI修复面临的主要问题是：(1)脊髓空洞、胶质瘢痕构成阻碍轴突生长的机械屏障；(2)原发和继发的神经元凋亡，使脊髓缺乏自我修复才能；(3)神经营养因子缺乏；(4)损伤部分存在抑制轴突再生的因素如Ng、髓磷脂相关糖蛋白等1。近年来，细胞移植在实验性SI的治疗中显示了良好的效果，给SI的治疗带来了新的希望。本文对细胞移植治疗SI的研究进展进展综述。细胞移植可以通过改变SI后的病理过程从而促进脊髓功能恢复，主要包括：(1)移植物可填

2、充损伤部位并形成细胞桥，从而为损伤轴突的再生提供机械或生物通道；(2)分泌生长因子，为轴突或神经元再生提供必要条件；(3)替代或提供新的神经元从而形成新的神经环路。目前细胞移植研究较多的是胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞、脐血干细胞、雪旺细胞及嗅鞘细胞等。1干细胞移植干细胞具有自我更新和多向分化的才能，体外培养可以向神经元和神经胶质细胞等多种细胞分化，同时也是SI基因治疗的理想载体细胞。干细胞不仅可以从胚胎组织获取，而且可以从成年哺乳动物的脑或脊髓等组织中获得，其别离纯化及培养扩增方法已较为成熟。1.1胚胎干细胞(ebrynisteells，ESs)ESs是从动物早期胚胎内细胞团中别离出

3、来的多能性细胞，它有与早期胚内细胞群相似的生物学特征。1998年，Itskvitz-Eldr等2首次从人类的囊胚获得了ESs并建立了人的ESs系。ESs经体外培养、诱导分化为少突胶质细胞和星形胶质细胞前体细胞后植入脱髓鞘病变大鼠模型的体内，结果说明ESs源性的前体细胞可与宿主神经元建立联络并为再生轴突髓鞘化3。Hard等4从基因修饰方面对ESs进展研究，将编码抗凋亡蛋白的bl-2基因对ESs进展修饰，移植入SI部位，6周后发现移植部位发生明显的异常生长，病理检查发现移植部位发现大量未分化细胞，并向首尾端各移行达1.5，结果说明bl-2修饰的ESs可以导致细胞的瘤样生长，同对照组相比有更高的死亡

4、率。目前研究来看，ESs用于SI的治疗效果是肯定的，但是也存在许多问题有待解决，比方临床应用存在感染逆转录病毒及其它病原体的危险。尤其ESs移植所涉及到的伦理方面的问题及来源问题限制了其临床应用5。1.2神经干细胞(neuralsteellS，NSs)胚胎组织移植促进脊髓再生的根本原因在于其含有的大量NSs，目前已经可以别离和体外培养NSs使之分化为各种神经细胞。NSs具有增殖、自我更新和多向分化才能。成年哺乳动物的中枢神经系统存在一些休眠的NSs。SI后这些NSs可以复苏、增殖、分化来代替坏死凋亡的神经元。Kulbatski等研究说明6，NSs不仅存在于胚胎神经系统，如大脑皮质、海马、纹状体

5、、嗅球、脑室沿线包括侧脑室、第三脑室和第四脑室、间脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜中，也存在于成年动物脑的某些部位，因此NSs在哺乳动物胚胎期神经系统中的分布具有较大的普遍性。NSs与其它干细胞类似，在体内的分化过程均受到部分环境中各种信号分子的作用，在环境信号的作用之外，干细胞本身对不同信号的敏感性及不同信号浓度的反响性不同，且表现出分化的时序性，复杂的内外信号系统共同决定着NS最终的走向。王岩峰7,8等通过对海马源性研究说明NSs移植后可以改变脊髓损伤区的微环境，上调脑源性神经营养因子RNA，促进生长相关蛋白43RNA的表达，并认为NSs移植后可存活并促进髓鞘蛋白前脂蛋白基因的表达，是促进脊髓

6、损伤后髓鞘再生的机制之一。2022年，Nakaura等9从8-9周胚胎脊髓别离的富含NSs的组织移植物在体外进展培养扩增并用BrdU标记，移植入成年狨猴SI部位后发现移植的NSs存活良好并移行到距损伤中心7处。双重荧光免疫染色结果说明移植后8周，NSs分化成为神经元和少突胶质细胞。同对照组相比实验组有更多的神经微丝。对实验动物进展功能评价，实验组优于对照组。移植NSs于损伤脊髓替代或补充损伤的神经元，诱导其向特定细胞类型分化并与宿主神经元形成突触联络，是一种非常具有潜在临床应用价值的方法。1.3骨髓基质细胞(BnearrStralellS，Ss)在骨髓除造血干细胞之外还存在一类具有干细胞特点并

7、可以向多种非造血组织分化的细胞，被称为骨髓基质细胞。Ss具有治疗SI潜能，可以进展自体别离培养扩增移植，从而防止了伦理方面的问题和免疫排挤反响。加之取材、培养简单，因此被认为是进展人体基因治疗的理想载体细胞。Ss可分化为多种非造血组织细胞，而且可以对其利用腺病毒或反转录病毒进展基因修饰10，培养后重新移植入病人。Dezaa等11将大鼠和人的Ss别离培养并定向分化成为神经元和雪旺细胞。将分化来的神经元和雪旺细胞进展移植治疗SI在动物实验中获得了良好的效果。Bakshi等12从表达人胎盘碱性磷酸酶的转基因大鼠获取骨髓基质细胞，利用腰穿技术将Ss移植入SD大鼠的SI部位，降低了SI的囊变和再损伤，获

8、得满意的疗效，移植入脊髓半切的大鼠脊髓内的人Ss无需进展免疫抑制即可存活数月而没有炎症或免疫排挤反响的迹象。这些优点使Ss成为临床基因治疗SI的可选择细胞。1.4脐血干细胞(huanubilialrdbldtells，HUBs)人HUBs具有多向分化潜能，在体外培养或体内移植后可分化为神经细胞，并可促进神经损伤动物的功能恢复。从遗传学角度来讲HUBs比Ss更合适于移植治疗SI。Kuh等13将HUBs移植入大鼠SI部位，通过免疫荧光染色，BBB功能评分，结果说明HUBs移植组较对照组有更好的疗效，而HUBs结合脑源性神经营养因子(Brain-deriredneutrphifatr，BDNF)组较

9、其它各组疗效更佳。双重免疫荧光染色证实HUBs分化为各种神经细胞，并诱导运动功能恢复。Zha等14将磁柱分选的脐血D34+造血干细胞和骨髓S直接移植到脊髓半切模型大鼠的损伤区周围，结果发现，虽然两组大鼠的神经功能均有明显改善，但前者较后者在移植后7d和14d的功能改善更为明显。这说明，在促进SI的功能恢复方面，脐血D34+细胞比骨髓S发挥作用的时间窗要早。同时，脐血细胞分化、替代损伤的神经元可能不是损伤修复的唯一机制，还可能通过分泌营养因子和调节自体免疫过程来实现神经保护功能。HUBS来源丰富，取材方便，无任何生理与伦理问题，且有较强的增殖分化才能；HUBS的低免疫应答性使得同胞间或非血缘供者

10、移植后的急、慢性移植物抗宿主病的发生率低且程度轻，这些优点将使HUBs成为SI临床治疗的一个研究方向。2雪旺细胞(Shannells，Ss)Ss是周围神经的主要构造和功能细胞，在神经再生中起着重要作用。Ss在神经损伤后，分裂、增殖形成Bungner带，引导轴突生长，并能合成分泌10余种Ss源性神经营养因子，如神经生长因子、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、成纤维细胞生长因子等和层粘蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质以及神经细胞粘附分子等细胞粘附分子，起到防止周围神经损伤后引起的神经元逆行性死亡，引导和促进轴突再生以及促进髓鞘形成的作用15,16。近年来，利用Ss移植促进中枢神经系统轴突再生的研

11、究进展迅速。经培养纯化的Ss，无论在体内或体外均能支持和促进脊髓神经突起的生长。Takai等17以NYU法制作大鼠Sl模型，分别将嗅鞘细胞、Ss以及二者混合移植入损伤部位，12周后行脊髓病理切片、免疫组化染色，结果发现3组脊髓空洞体积均较空白对照组明显减小，细胞向损伤部位两端扩散。Ss移植组轴突再髓鞘化程度明显高于其他3组；Ss移植组实验动物功能恢复最好。从而认为Ss移植在SI修复中的作用不可替代。Ss移植入SI部位促进轴突再生和功能恢复详细机制如下：(1)SI后，Ss可桥接损伤区，并分裂、增殖形成Bungners带，引导轴突生长；(2)形成髓鞘，覆盖再生轴索：(3)减轻空腔形成和星形胶质细胞

12、反响，并可以吞噬部分胶质瘢痕；(4)Ss可分泌神经营养因子，而神经营养因子是对神经细胞的生长发育、分化再生及功能具有调节作用的蛋白。目前关于Ss的研究倾向于以下两个方面：基因修饰Ss和自体激活Ss。2.1基因修饰后的Ss移植治疗SI随着分子生物学的开展，通过转基因技术，可以将表达特定物质的目的基因通过重组腺病毒或逆转录病毒、质粒等转入靶细胞内，并保证其存活、分泌生长因子以及引导轴突生长所需的细胞外基质等。近年来基因治疗已被广泛应用于SI治疗，它可以提供长期、平安、部位局限的促进脊髓功能恢复、轴突再生的物质；不仅如此，它还可以向中枢神经系统中的特定部位的本质内运送营养因子，从而成为当今SI治疗中

13、的一大热点。冯世庆18等将NGF和BDNF基因修饰的Ss应用于SI的治疗，实验说明转基因Ss可以持续大量分泌神经营养因子，从而让部分释放的神经营养因子不断刺激、引导宿主纤维和移植物的整合与联络，促进SI的修复。陈礼刚等19将pSVPat微基因修饰雪旺氏细胞(S)脊髓内移植，研究显示PSVPat微基因修饰S可抑制GFAP的表达，促进SI后神经元的功能恢复以及神经轴突的再生。基因修饰的Ss具有以下特点：(1)移植后能在中枢神经系统内长期存活；(2)能分泌高程度的神经营养因子；(3)使轴突髓鞘化；(4)能诱导对神经营养因子反响的轴突生长旺盛；(5)可在体内长时间的表达转移基因。Ss不仅本身即可促进中

14、枢神经系统的再生、髓鞘的重建和部分神经功能的恢复，同时又可作为SI基因治疗的移植载体。2.2自体激活的Ss治疗SI对自体Ss移植的研究一直进展迅速，为了可以更加迅速有效别离Ss，Vreen等20利用磁性活细胞分类(agneti-atiVatedellseparatin，AS)技术别离表达p75低亲和力神经生长因子(laffinitynervegrthfatrreeptr，p75LNGFr)的Ss，为临床解决Ss来源提供迅速有效的方法。国内冯世庆21,22等将自体激活的Ss植入SI动物模型，自体激活Ss移植后通过顺行示踪法标记脑部皮质脊髓束；标记移植物和P0免疫组化法观察移植物的存活情况；光镜观

15、察脊髓组织形态学改变；并对大鼠后肢神经功能恢复情况用BBB评分进展评价，综合评价对脊髓组织形态与功能的修复作用。并将此研究成果应用于临床，选择适宜的SI志愿者行自体激活Ss移植I期临床研究。结果说明：(1)采用自体激活Ss移植治疗SI，其自体激活的Ss可持续大量分泌脊髓再生所必需的神经营养因子，显著促进受损神经元再生，诱导再生轴突通过损伤脊髓和移植物界面；(2)移植的Ss可以填充损伤后的脊髓空洞，诱导轴突再生，连接损伤轴突的远、近端，恢复脊髓的解剖完好性，受损的轴突髓鞘化，恢复脊髓的传导才能；(3)自体激活Ss混悬液中含有的巨噬细胞可以吞噬胶质瘢痕，减少脊髓再生抑制性微环境的产生；(4)自体细

16、胞移植无免疫排挤反响，不涉及伦理问题。随着Ss的提娶纯化、培养扩增技术和转基因技术、自体激活技术的成熟，Ss移植治疗SI成为最有希望应用于临床的方法之一，但SI后功能的恢复很大程度上依赖于再生的轴突能否顺利穿过胶质瘢痕交界区域，能否建立有效的突触联接。植入的Ss在部分的迁移间隔 非常有限；而且其植入损伤脊髓后是否能长时间存活，从而最大限度地保证损伤轴突再髓鞘化和脊髓再生也尚未确定22,23。因此，如何保持Ss移植入SI部位后的生物活性并增加其迁移范围，使再生轴突打破SI胶质瘢痕界面，建立由功能的突触联接将是今后研究的方向之一。3嗅鞘细胞(lfatryensheathingells，Es)嗅粘膜

17、神经元是体内唯一生后形成的神经元，它在成熟的个体内可持续分裂，Es在成年哺乳动物终生都可以成功地诱导嗅觉轴突再生。E是一种特殊的胶质细胞，分布于嗅神经的全长构成嗅神经元赖以生存的外环境。Es兼具雪旺细胞和星形胶质细胞的特点，但它与二种细胞又不同。原位杂交研究提示E不仅可以分泌神经营养因子还能表达层黏蛋白、纤黏连蛋白、胶质源性连接素和神经细胞黏附分子等促进轴突的修复和再生。Lpez-Vales等24将Es移植入大鼠T8SI部位，运动功能得到显著改善，为临床应用Es治疗SI提供理论基矗Sants等25的实验结果显示，SI后植入Es，大鼠的运动功能和感觉运动反射得到恢复，相关的上运动神经元轴突再生长

18、入脊髓横断处的远端组织内，并生长较长间隔 。然而也有一些作者持不同意见，一些实验研究说明并非Es直接促进了髓鞘化和轴突再生26。Es植入SI部位后，增强了损伤部位自体雪旺细胞的内在功能，和雪旺细胞一起为轴突再生提供良好的三维立体微环境。转贴于论文联盟.ll.llazs-astr等27通过实验说明Es植入SI部位后实验动物的运动功能并没有得到改善，反而可以导致轴突的异常生长。作者建议在进展临床之前，应该作进一步研究。尽管关于Es的功能众说纷纭，但是植入Es是治疗SI的一种有希望的方法，用Es治疗人类SI，可直接从患者的嗅粘膜获得Es并进展培养，用于治疗SI，可解决免疫排挤反响问题。目前自体Es移植治疗SI已经进入I期临床研究阶段28，29，但真正应用于临床治疗SI尚需时日。4总结与展望SI损伤修复实验研究中细胞移植为进步轴突再生才能、替代细胞成分、阻止脱髓鞘和使髓鞘再生等，从而促进脊髓修复，进而为感觉及运动功能的恢复提供了时机，而且某些方面已获得了可喜成就，有些甚至已经进入了临床