平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究

1、平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究【摘要】目的为开发利用平白术的药用价值提供理论根据，分别提取别离平白术中有效成分多糖和氨基酸，并分别测定平白术多糖和氨基酸的含量。方法采用L934实验因素设计实验，苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。以茚三酮为衍生试剂，采用柱后衍生法测定平白术中氨基酸含量。结果平白术多糖的含量为15.3%。平白术中至少含有17种氨基酸，总氨基酸含量为73.73gg-1。结论方法简单、有效、快速、准确、灵敏，合适于分析测定白术中多糖和氨基酸的含量。【关键词】平白术；多糖；氨基酸Keyrds:AtratyldesarephalaKidz；Plysaharide;Ainaid白术是传

2、统中药，?中国药典?收载的白术为菊科植物AtratyldesarephalaKidz的枯燥根茎，白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之效1。?中国药典?2022年版第一部记载含白术的处方有91个。近几年以来，中国对白术的需求量大增，居全国大宗常用中药材之首。由于其含有白术多糖、挥发油、氨基酸等多种有效成分而倍受药物研究工作者的关注，使白术的临床应用日趋广泛2，其研究也更为深化、更为多元化。然而，迄今为止，对白术中营养成分氨基酸研究甚少。为了开发利用白术的药用价值，本文对湖南平江产白术平白术进展研究，提取平白术多糖、氨基酸，采用正交实验选择多糖显色条件，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。以茚三酮作衍生

3、试剂，采用柱后衍生法测定氨基酸含量。1材料1.1仪器1.2试剂无水乙醇、硫酸锌、氢氧化钡、硫酸、苯酚、茚三酮、柠檬酸。三钠、醋酸钠均为分析纯,平江白术由湖南药材公司提供、果糖标准品市售、氨基酸标准品中国科学院亚热带农业生态研究所提供。2方法与结果2.1显色条件的考察2.1.1苯酚浓度对显色单因素的影响汲取标准溶液1l于10l具塞试管中，精细参加1l不同浓度的苯酚和5l浓硫酸，混匀，放置5in。移入25的水浴中保温20in。冷却。以蒸馏水1l加相应的试剂作空白，测定吸收度。见图1，表1。表1苯酚浓度的考察略实验结果说明,苯酚浓度在4%7%范围内所得吸收值相近,苯酚浓度为5%时所得吸收值较大,应选

4、择苯酚浓度为5%。2.1.2苯酚-硫酸法正交实验设计3实验因素程度表设计：实验选择苯酚用量5%苯酚、浓硫酸用量、水浴温度和水浴中的放置时间4个因素作为考察对象，根据初步实验，每个因素确定3个程度，采用L934正交表进展实验见表2。以吸收度为评价指标表3。对结果进展统计学处理，得方差分析见表4。表2实验因素程度略表3L934正交实验结果略表4方差分析略经方差分析可知，苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度及水浴放置时间对吸收度影响不显著，但综合比拟，本实验选择苯酚-硫酸法最正确显色条件为A3B13D2即苯酚1.2l，浓硫酸4l，水浴温度25，水浴放置时间30in。2.2测定波长的选择精细称取一定量多糖样

5、品置小烧杯中，加水溶解，定量转移至100l量瓶中，加水至刻度，混匀。汲取该样品2l于试管中，加5%苯酚水溶液1.2l混匀，迅速参加4l浓硫酸，振摇10in，在25水浴保温放置30in，取出冷却，以苯酚-硫酸溶液为空白，于400800n范围扫描，选择最大吸收波长488.4n为测定波长。2.3标准曲线精细称取105枯燥至恒重的标准果糖18.70g，加水溶解至250l，配成74.8g/l的标准储藏液。取10l具塞试管，分别加上述标准液0.0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70l，加水稀释至1l，摇匀，每个试管各加5%苯酚水溶液1.2l混匀，再迅速参加4l浓硫酸，振摇

6、10in，在25水浴保温放置30in。以水作空白在488.4n处测定各标准液的吸收度，得回归方程A=0.0983+0.0.0926r=0.9994。其在120.6g/l浓度范围内呈良好的线性关系。转贴于论文联盟.ll.2.4换算因素测定精细称取枯燥的平白术多糖20g，用蒸馏水溶解后定容至100l，作为多糖储藏液。准确量取多糖储藏液0.2l，加水至1.0l，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度值。按下式计算换算因素：f=/D，试中：为多糖质量g，为多糖液中果糖的浓度g/l，D为多糖的稀释因素，测得f=1.24。2.5平白术多糖、氨基酸的提取2.5.1平白术多糖的提取4精细称取白术粗粉50g置于10

7、00l的容量瓶中，加6倍量70%的乙醇回流2h。过滤，取滤渣加8倍蒸馏水回流2h，趁热过滤。在滤渣中加6倍水回流1h，趁热过滤。再在滤渣中加3倍量水回流1h，趁热过滤，合并3次滤液，浓缩至100l，加无水乙醇至乙醇浓度达85%，再用75%乙醇冲洗，离心，反复6次，去溶液取沉淀。加水溶解，用5%ZnS44l和饱和BaH2溶液16l振摇，离心去蛋白，反复10次5。将所得溶液置于冰箱中过夜，次日取出溶解，在8000r/in离心15in，反复4次。用氯仿-正丁醇41与溶液按51的比例混合搅拌15in，离心，反复3次，得澄清液即白术多糖溶液。加水至100l冷藏备用。2.5.2平白术氨基酸的提取称取平白术

8、粉末40g过80目投入装有搅拌器、温度计、回流冷凝器的三颈烧瓶中，参加6l/L的盐酸100l，加热水解24h，反响温度保持在(1101)左右。滤渣用少量稀盐酸浸泡，过滤，重复两次，搜集3次滤液得水解液，加热7h赶盐酸。在滤液中参加0.5g活性碳且维持滤液在(8090)，磁力搅拌脱色30in，重复2次，减压浓缩得到50l橙红色的溶液，作为储藏液。于4的冰箱中保存。2.6平白术多糖和氨基酸含量的测定2.6.1样品多糖含量的测定平白术多糖提取液稀释至适当倍数后，精细汲取1.0l，按照标准曲线的方法测定吸光度，计算平白术多糖的含量。按下式计算多糖含量：多糖含量=Df100%，式中：为多糖质量g，为多糖

9、液中果糖的浓度g/l，D为多糖的稀释因素，f为换算因素。测得多糖的含量为15.3%。2.6.2回收率实验在样品液中精细参加不同浓度的果糖标准液n=5，按2.3项下操作，并适当稀释，以样品液为空白，测定吸收度，计算回收率。平均回收率为98.5%，RSD=2.1%n=5。结果如表5。表5回收率实验结果略2.6.3稳定性实验取样品在8h内测定吸收度，1次/h。样品在4h内稳定，RSD=1.2%。2.6.4平白术氨基酸的测定条件6实验条件：L-8800型全自动氨基酸分析仪，钠型阳离子交换柱4.660，分析时间35in，流动相柠檬酸三钠缓冲液pH3.24.9，四元梯度洗脱，缓冲液流速0.4l/in，茚三

10、酮流速0.35l/in，缓冲液泵压力811.5Pa，茚三酮泵压力0.91.2kPa，柱温50，氮气压力20kPa。柱的衍生条件：反响液A：390g茚三酮/L丙二醇甲醚，反响液B：醋酸钠/醋酸：丙二醇甲醚6040；供试品和对照品溶液进样量均为20l。2.6.5平白术氨基酸含量的测定按上述色谱条件，使用日立L-8800AAA分析仪进展样品测定。别离得到的氨基酸谱图如图23。样品中氨基酸的含量结果见表6。表6平白术中氨基酸含量测定结果略3讨论3.1本实验采用75%乙醇提取除去平白术所含单糖、低聚糖等干扰性成分后，再用水提醇沉法制得白术多糖。在采用Sevag法去蛋白至少重复67次，才能根本上除去蛋白，

11、且多糖损失率也较大。本实验采用硫酸锌与饱和氢氧化钡溶液脱蛋白后，再加冷冻-Sevag法除蛋白，去蛋白比拟彻底。在进展乙醇沉淀时，85%的乙醇浓度已能将多糖根本沉淀出来，增加乙醇浓度对多糖的得率影响并不显著。多糖采用真空枯燥法，可防止加热枯燥而出现多糖变黏稠或碳化而结块现象。3.2氨基酸是构成生物体蛋白质分子的根本单位，与生物的生命活动亲密相关，尤其与人类安康有着严密的关系。本分析结果说明，平白术氨基酸至少含有17种氨基酸，总含量为73.73gg-1。必需氨基酸和半必需氨基酸在人体中具有重要的作用，缺一不可，否那么可引起生理功能异常，导致疾玻总氨基酸中含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等7种人体必需氨基酸，并含胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸等4种半必需氨基酸。必需氨基酸和半必需氨基酸在总氨基酸中分别占12.7%，17.8%。在水解氨基酸时，温度应严格控制在1101，水解24h，才能使蛋白质完全水解。3.3本研究为白术中有效成分多糖及氨基酸的提取分析、质量评价提供了一个新的定量标准，为开发利用平江白术提供了理论根据。【参考文献】1国家药典委员会.中国药典，部S.北京：化学工业出版社，2000：77.2刘思贞，邵玉芹，祝希娴.白术药理研究进展J.时珍国医国药，1999，108：634.3张维杰.复合多糖生化研究技术.上海：