实验四蛋白酶活力的测定

1、关于实验四蛋白酶活力的测定第1页，共9页，2022年，5月20日，22点13分，星期三一、实验目的掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。进一步理解酶活力和比活力的概念巩固比色法测定物质含量的基础，掌握分光光度计使用方法，学习绘制标准曲线的方法第2页，共9页，2022年，5月20日，22点13分，星期三二、实验原理1胰蛋白酶是一种水解酶，将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。2所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，680nm）。3用

2、分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。第3页，共9页，2022年，5月20日，22点13分，星期三三、器材仪器和主要试剂 可见光分光光度计 水浴锅Folin 酚试剂 0.5% 酪蛋白 100 g/ml Tyr 溶液三氯醋酸Na2CO3胰蛋白酶第4页，共9页，2022年，5月20日，22点13分，星期三四、实验操作1、酪氨酸标准曲线的制作管号123456样品、对照滤液（各2支试管）100g/ml

3、 Tyr (ml)00.20.40.60.81.0每支管加1ml水（ml)1.00.80.60.40.20稀释后Tyr浓度（g/ml）020406080100Na2CO3 (ml)5555555Folin-酚试剂 (ml)1111111迅速混合，于40放置15分钟 A680nm调0 A样、A对照以酪氨酸的浓度（g/ml）为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。 管号酶液（ml）酪蛋白（ml）三氯醋酸（ml）40水浴准确保温10分钟三氯醋酸（ml）酪蛋白（ml）40水浴保温10分钟，过滤得滤液 样品管12-3-对照管1-3-2第5页，共9页，2022年，5月20日，22点13分，星期三2

4、、蛋白酶活力的测定按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。滤液各取1ml，进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂1ml，40 C保温15min)以标准曲线中的1号管调0，测定A 样 (样品液A680nm值)和A 对 (对照液A680nm值)；管号酶液（ml）酪蛋白（ml）三氯醋酸（ml）40水浴准确保温10分钟三氯醋酸（ml）酪蛋白（ml）40水浴保温10分钟，过滤得滤液。 1 号(样品)12-3-2 号(对照)1-3-2第6页，共9页，2022年，5月20日，22点13分，星期三3. 酶活力计算胰酶活力定义： 40 ， pH7.5 ，反应10min，每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸

5、 1 微克为一个酶活力单位。计算：1g 蛋白酶所具备的总活力单位为： ( A 样 - A 对) K V/t N A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上A680nm为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（min），本实验 t =10min ； V ：酶促反应管的总体积（ml数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:6000第7页，共9页，2022年，5月20日，22点13分，星期三五、思考题酶的试验为何设对照又要设空白?稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。计算公式中的v=6该如何理解本实验用什么方法终止酶促反应?还有其他方法可以终止反应吗?如何保证本实验测定数据的准确性？