组织培养的方法和步骤

1、组织培养的方法和步骤日期：2010年4月1日 来源：互联网作者：植物组培网点击：3033要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方 面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取 材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消 毒作用，这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成 培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。第一步，将采

2、来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材 料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料 清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加 入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的 物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质一吐温。第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒 精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸1030s。由于酒精具有使植物材

3、料表面被浸湿的作用， 加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花 蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处 理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取12种使用见表。第四步是用无菌 水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-10次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂 杀伤植物细胞的副作用注意：酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精 杀死植物细胞。老熟材料，特

4、别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。升 汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。漂白粉容易导致植物材料失绿，所 以对于幼嫩材料要慎用。在消毒液中加入浓度为0.080.12%的吐温20或80 （一种湿润剂），可以 降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。灭菌剂 使用浓度（%）持续时间（min）去除的难易效 果次氯酸钙910 530易很好次氯酸钠2 530易很好氯化汞0.11 58较难最好抗菌素450mg/L 3060中较好制备外植体将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等， 叶片则不需剥皮。在操作中严

5、禁用手触动材料。接种和培养（一）接种在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种1 2个，以防止交叉污染。（二）封口接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。（三）温度培养基大多应保持在25C左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。增殖外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切 段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右 后，可视情况进行再增殖。根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得 键壮根系。组培苗的炼苗

6、移栽试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前， 先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再 栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度 （相对湿度98%左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。组织培养中的清洗、消毒灭菌技术日期：2010年4月1日 来源：互联网作者：植物组培网点击：21901、清洗植物组织培养用的各种玻璃器皿，特别是培养瓶和盛培养基的器皿，一定要严格清洗，以防油污、 重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗，先

7、将污 物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采 用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌 体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定 的地方，便于取用。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸 煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲 醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要 根据工作

8、中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高 压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅 内温度也随之增加。在o. 1MPa的压力下，锅内温度达121C。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细 菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有 几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀， 通电后，待压力上升到O. 05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三 次放气后，关阀再通电，压力表上

9、升达0. 1-0. 15Mpa时，维持15-20min。对高压灭菌后不变质的 物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间， 既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验 服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。高压灭菌前后的培 养基，其pH值下降0.2-0.3单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌 前用碱调高pH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭 菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个

10、pH值单位。环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生 明显的生理影响。高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%-20% 蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0. 43倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使 15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5,其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭 时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使 用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放

11、入 95%的酒精，以便插入工具。干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到160-180C的温度来杀死微生物。由 于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170C持续90min 来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用 耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免 妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭 菌能源消耗太大，浪费时间。过滤灭菌（不耐热的物质）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和

12、某些维生素是不耐热的， 不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。可用无菌的孔径0.20-0.45um的硝酸纤维素膜过滤菌类， 当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时， 常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过 滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。紫外线和熏蒸灭菌（空间）（l）紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭 菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成 死亡。紫外线的波

13、长为200300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的 能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。（2）熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表 面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭 紧密，按58ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预 先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多，它们使微生物 的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细

14、胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。 一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所 以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和 酒精例外。喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等， 可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25% 1%的新洁尔灭也可以。3、无菌操作植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作 人员的衣物都要无菌，而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程，如少有疏

15、忽，都会造成无 法挽回的后果，使工作前功尽弃。工作人员在进行无菌操作是要严守以下几点：a.入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。上入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用70的酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，亦不准对着操作 区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖 子也在火焰上烧一下，然后盖上。培养物的不良表现及措施日期：2010年4月1日 来源：互联网作者：植物组培网点击：2064一：培养物的不良及改进培养物水浸状、变色、

16、坏死、茎断面附近干枯可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。培养物长期培养几乎无反应可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D， 调整培养温度。愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增 加培养基硬度。愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢可能原

17、因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。侧芽不萌发，皮层过于膨大，皮孔长出愈伤组织可能原因:枝条过嫩，生长素、细胞分裂素用量过多。改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。二：培养物的不良表现及改进措施（继代培养阶段）苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。改进措施：减少或停用细胞分裂素

18、一段时间，调节温度。分化率低，畸形，培养时间长时苗再次愈伤组织化可能原因:生长素用量偏高，温度偏高。改进措施：减少生长素用量，适当降温。叶粗厚变脆可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基。再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式。丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空 间窄。改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强

19、光照，及时转接，降低接种密度， 更换封瓶纸的种类。幼苗淡绿，部分失绿可能原因：无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适， 激素配比不当。改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。三：培养物的不良表现及改进措施（生根阶段）培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位勇气

20、不良；生根程序不当；PH值不适，无机盐浓度及配 比不当。改进措施：改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液 培养生根等。愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。可能原因：生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度，附加VB2或PG等减少愈伤，改变 生根培养程序等。组培苗的褐化问题日期：2010年4月1日 来源：互联网作者：植物组培网点击：2034很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类 物质氧化为棕

21、褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结 果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。影响褐变的因素很多，植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程 度的影响褐变的程度。一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。培养基中含酚 过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。6-苄氨基嘌吟（6-BA）和激动素（KT） 也有诱导褐化的作用。强光和高温同样会促进褐化现象。为了防止外植体的褐变，需要选取酚类化合物含量较低的实验材料，选择无机盐含量较低，不加肌醇 的培养基，并在较弱的光线或黑暗的条件

22、中进行培养。在培养基中加入抗氧化剂是防止褐变的有效措施。常用的抗氧化剂有抗坏血酸（VC）、柠檬酸、半胱氨 酸、二硫苏糖醇和聚乙烯毗咯烷酮（PVP）等。可用抗氧化剂溶液预先处理外植体，或者在抗氧化剂溶液 中切割和剥离外植体。必要时还可以将几种抗氧化剂结合使用。也可以将抗氧化剂加入到培养基中。另一 种方法是在培养基中加入0.51%的活性炭，吸附对生长有抑制作用的褐色醌类物质。应当注意的是：活 性炭也能吸附培养基中的激素类物质，影响茎尖的分化和生长，因此在使用活性炭的场合，需要适当提高 培养基中激素的浓度。还有一种办法是不断地（每隔12d）将培养物转移到新鲜的培养基上，以摆脱老 培养基中褐色物质的不

23、利影响。在使用液体培养基的情况下，这种方法相当有效。在培养基中添加活性碳可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化。对形态发生和器官形成有良 好作用。一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体 吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高是吸附力减弱，甚至会解吸附。通常使用浓度为 0.5-10g/L。加入活性炭后使培养基变黑，对一些植物诱导生根有利。大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝 固能力，因此要多加些琼脂。很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶。植物外植体组织在接种时的切割面会溢泌一些酚类物质，在接触空气中的氧气后其会氧化为

24、相应的醌类 物质，产生可见的茶色、褐色或黑色，此即谓酚污染”。在木本植物，尤其是热带木本植物及少量草本植 物中，此现象较为严重。常用的防治措施如下：试用抗酚类氧化的药剂（半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需 用浓度为50-200mg/L。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层， 或将刚切割的外植体浸入其中一定时间）适当降低培养基温度。接种后先进行一定时间的暗培养。及时转接入新鲜培养基。巳选择切取外植体部位等。经验之谈：1、易发生褐化的作物在进行组织培养时，先进行预培养（即培养在基础培养基中）23天（如果分泌物 多，如利用花魔芋的球茎

25、进行组织培养时，适当延长预培养时间并多次更换培养基），再培养到添加了激 素的培养基上。组培苗的玻璃化问题日期：2010年4月1日 来源：互联网作者：植物组培网点击：1876在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸 状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不 具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管苗生长异常现象就是P.Debergh（1981）首先命名的玻璃化” （Vitrification）。是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤

26、维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织 等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用 作继代培养和扩大繁殖的材；生根困难，移栽后也很难成活。植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一 种很普遍的现象，该苗有时多达50%以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料 保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相 当严重的，也是亟待解决的问题。（一）玻璃苗发生的因素琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。Daniel G. W. Brown认

27、为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。碳源不仅为芽的形成提供能量，而且也起渗透调节作用，主要影响培养基的渗势（Salisbury等）。随琼脂浓度及纯度的增加， 培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。Debergh等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的 形成，Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。刘思颖等（1988）测得丝 石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的1.9倍，含水量为正常苗的2.09倍一2.21倍。自由水和高湿度可能 与肉质嫩梢的形成有关。Davis等研究表明，液体培养是导致玻璃化的主要原因。可以断定，试管苗玻璃 化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变

28、态。许多学者证明培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗 比率越大。Debergh曾用14C-KT研究表明，随琼脂浓度的增加，KT利用率降低。同时也证明，随BA 浓度的增加，玻璃化率增加。Bornman等用14C- BA研究表明，14C-BA的积累与不定芽分化和玻璃化 是同步的。玻璃化苗的一个重要特征是叶脉明显加长，而GA3也有类似效应，也许GA3促进了细胞过度 生工，从而导致玻璃化。生长素可以改变细胞壁的机械特性，使其具有更大的可塑性。许多研究表明，非受伤的物理和化学协迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被认为是一种非受伤协迫条件下 形态上的反应。玻璃苗苯丙氨酸

29、解氨酶（PAL）的活性低于正常植株。在协迫条件下乙烯的快速合成，又 通过抑制氨基环丙烷羧酸（ACC）酶的形成，对乙烯起反馈调节作用。通过改善气体交换防止玻璃化形成， 可能与克服乙烯反馈抑制有关。一种与膜有关的过氧化物酶直接或间接掺入ACC合成乙烯。现已证明，IAA- 氧化酶体系至少在乙烯合成的最后一步起作用。IAA含量降低将进一步通过IAA调节S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化成ACC这一过程，从而降低了乙烯形成。Kevers等曾证明，对于玻璃苗，碱性过氧化酶同 功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但总可溶性过氧化物酶活性增加，仅限于碱性提取物。有人认为， 玻璃化的形成主要是膜的效应而与核酸无关。

30、乙烯促进了叶绿素分解及细胞的畸形发展。乙烯处理破坏了 膜的结构，随着细胞壁解离，细胞内积累有在量纤维素及泡状物质。可见，乙烯对玻璃化的影响，与改变 组织的生理生化及纤维结构有关。 Hakkart F. A.等认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。密闭的封 瓶口材料是导致玻璃化的原因之一（陈国菊等1992,李云等1996）。培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素。有人发现不同部位的节段外植体与玻璃化有关，以留兰香基部节段所形成的试管苗玻璃苗严重，中部 茎段次之，茎尖最好（柴明良）；重瓣丝石竹中部茎段出现玻璃苗较多，基部茎段较少，茎尖没有（郭达

31、初）。郭东红等（1989）认为瑞香茎尖外植体大小与玻璃化相关，茎尖外植体越小，出现玻璃苗比率越大。（二）玻璃苗发生的机理 Kevers等的试验表明，苹果砧木M7等的玻璃苗是由于过氧化物酶一一吲哚乙酸氧化酶系统 控制的乙烯过饱和的影响，并认为细胞激动素和NH4+离子的过剩是一种最初的胁迫，受胁迫的试管苗在 乙烯过剩的空气中，抑制了乙烯的生物合成，结果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性过氧化物酶的活性， 从而妨碍组织木质化，导致形成玻璃苗。一种诱导协迫（过多的细胞分裂素和NH4+），可以通过酚含量 的快速化调节不断增加的过氧化物酶活性。乙烯的大量形成又对其自身起反馈抑制作用，结果PAL和酸

32、性 过氧化物酶活性降低，从而抑制木质化过程的进行。糖用于氨基酸的合成，纤维素含量降低。由于缺乏纤 维素和木质素，壁压降低，从而细胞过分吸水，并导致玻璃化。张洪胜等认为在试管苗玻璃化过程中，作为内源激素的乙烯从代谢调节上起了关键性启动作用。而 乙烯的产生则取决于培养环境中的胁迫条件，如水势不当，通气不畅（造成缺氧）及培养基用BA量过高 等，均会导致乙烯产生。乙烯产生后引发了其他激素质和量上的改变及酶类的变化。因此，发生蛋白质、 纤维素和木质素的合成障碍及降解，叶绿素分解黄化，逐渐形成玻璃化症状；张昆瑜等Q991）认为乙烯 克服试管苗玻璃化的机理是复杂的，在添加乙烯前体ACC （1-氨基环丙烷-1

33、-羧酸）和乙烯释放剂CEPA （乙烯利）的培养基上证明乙烯对香石竹试管苗干物质积累及组织、器官的发育有利。并发现ACC可促进 烟草愈伤组织中的过氧化物酶和苯丙氨酸裂解酶的活性，加强磷酸戊糖途径与抗氤交替途径，前两个酶是 促进木质素合成和细胞壁形成的关键酶，磷酸戊糖途径与叶绿素前体的合成有关，抗氤交替途径则降低了 ATP的合成，从而抑制了过度主动吸水，提高了蛋白质和干物质的含量。李云等（1996）发现植物光呼吸途径和磷酸戊糖（HMP）途径均与玻璃苗的产生有关，即当上述两 条呼吸途径的一条或两条同时受阻时，均增加玻璃苗。密封瓶口、高温、高浓度细胞分裂素等因子加快了 生长速度，加剧了瓶中气体组成的改

34、变，对瓶内外气体交换提出更高要求，当这种要求不能满足时便出现 玻璃化。HMP途径的中间步骤与戊糖化合物代谢有关（如核酸合成），也与木质素形成有关。当HMP途 径被抑制时，壁的再生受抑制，戊糖化合物减少，核酸、蛋白质合成受阻。当光呼吸途径被抑制时，减弱 了光呼吸对光合的保护作用，过剩的同化物损坏了光合细胞器，不仅降低了光合作用，同时也阻碍了乙醇 酸的的转化，加重了乙醇酸对植物的毒害作用，从而导致玻璃化的产生。（三）防止和克服玻璃苗的措施尽管关于玻璃化的成因及其生理机制到目前为止仍未得出一致的结论，但对某些植物的玻璃化已得到 有效的控制。这些研究表明，控制玻璃化要从培养的环境条件和生理生化方面入手

35、，具体措施如下：利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏。提高琼脂纯度，也可降低 玻璃化。适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的 水分，造成水分胁迫。降低培养容器内部环境的相对湿度。适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度。控制温度适当低温处理，避免过高的培养温度在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好。增加自然光照。试验发现，玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的 紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低N和Cl元素比例，特别降低铵 态

36、氮浓度，提高硝态氮含量。改善培养容器的通风换气条件，如用棉塞或通气好的封口膜封口。青霉素G钾（2mg/L6mg/L）能有效防治菊花试管苗的玻璃化（陈龙清等），青霉素（40万单位 /升）可降低芥菜试管苗的玻璃化（陈国菊等）。培养基中加入间苯三酚或根皮苷。用40r热击（周菊华等）处理瑞香愈伤组织培养物，可完全消除再生苗的玻璃化，且能够提高愈伤组 织的芽分化频率，热击处理会降低内源细胞分裂素水平。一些添加物可有效地减轻或防治玻璃化，如王家旺等添加马铃薯汁或活性炭降低了油菜玻璃苗频率;郭达初等用10mg/L15mg/L的CCC或0.5mg /L1.0mg/L的PP333减少了重瓣丝石竹试管苗玻 璃化的

37、发生；师校欣等（1990）添加1.5g/L-2.0g/L的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化；张昆瑜等增加容 器中乙烯含量克服香石竹玻璃化的发生。尽管如此，不同植物在不同条件下，也许会得出不同的结论或相反的结果。更有效的玻璃化控制途径， 有等于进一步研究组培苗的黄化问题日期：2010年4月1日 来源：互联网作者：植物组培网点击：1875黄化是指在组培过程中由于培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的幼苗整株失绿，全部 或部分叶片黄化、斑驳。这一现象在植物组织培养中比较常见，特别在部分木本花卉中较为常见，引起黄 化的主要原因是培养基中Fe的含量不足；各矿质营养不均衡；培养环境通气不良，瓶内乙烯

38、含量升高； 激素配比不当；糖用量不足或长时间不转移糖已耗尽；PH值变化过大；培养温度不适；光照不足等。解决的方法是，首先在配制母液和培养基的制作过程中，要检查仪器设备是否准确，还要认真细致地核对 每项称量的每一个环节；及时转接培养物；使用透气的封口膜以改善瓶内通气状况；适当调节pH值、激 素配比和无机盐浓度；配制培养基时切记不要忘记加糖；控制培养室内的温度；适当增加光照；另外，在 培养基中添加抗生素类物质如青霉素、链霉素、头孢霉素等，有时也会出现幼苗黄化现象，应适当减少用 量或停止使用。常用植物生长调节剂日期：2010年4月1日 来源：互联网 作者：植物组培网 点击：2242、植物生长促进剂（

39、一）生长素类1、吲哚乙酸，IAA分子式：C10H9O2N分子量：175.19性质:纯品无色.见光氧化成玫瑰红，活性降低。在酸性介质中不稳定，PH低于2时很快失活，不溶于水， 易溶于热水，乙醇，乙醚和丙酮等有机溶剂。它的钠盐和钾盐易溶于水，较稳定。用途：植物组织培养2、吲哚丁酸，IBA分子式：C12H13NO3分子量：203.2性质：白色或微黄色。不溶于水，溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。用途：诱导插枝生根。作用特别强，诱导的不定根多而细长。3、萘乙酸，NAA，相似的有萘丁酸、萘丙酸分子式：C12H10O2分子量：186.2性质：无色无味结晶，性质稳定，遇湿气易潮解，见光易变色。不溶于水，易溶于乙醇，

40、丙酮等有机溶剂。 钠盐溶于水。用途：促进植物代谢，如开花、生根、早熟和增产等，用途广泛。4、萘氧乙酸，NOA分子式：C12H10O3分子量：202性质：纯品白色结晶。难溶于冷水，微溶于热水，易溶于乙醇、乙醚、醋酸等。用途：与NAA相似。5、2, 4-二氯苯氧乙酸，2，4-D，2, 4-滴分子式：C8H6O3Cl2分子量:221性质：白色或浅棕色结晶，不吸湿，常温下性质稳定。难溶于水，溶于乙醇，乙醚，丙酮等。它 的胺盐和钠盐溶于水。用途：植物组织培养，防止落花落果，诱导无籽，果实保鲜，高浓度可杀死多种阔叶杂草。6、 防落素，PCPA，4-CPA，促生灵，番茄灵，对氯苯氧乙酸分子式：C6H7O3C

41、l分子量：186.6性质:纯品为白色结晶，性质稳定。微溶于水，易溶于醇、酯等有机溶剂。用途：促进植物生长；防止落花落果，诱导无籽果实；提早成熟；增加产量；改善品质等。常用于番茄保 果。7、增产灵，4-碘苯氧乙酸。相似的有4-漠苯氧乙酸，又称增产素分子式：C8H7O3I分子量：278性质：针状或磷片状结晶，性质稳定。微溶于水或乙醇，遇碱生成盐。用途：促进植物生长；防止落花落果，提早成熟和增加产量等。8、甲萘威，西维因，N-甲基-1-萘基氨基甲酸酯分子式：C12H11O2N分子量：201.2性质：纯品为白色结晶，工业品灰色或粉红色。微溶于水，易溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂。遇碱（PH 大于10）

42、迅速分解失效。用途：干扰生长素运输，使生长较弱的幼果得不到充足养分而脱落，用于苹果的疏果剂。同时它也是一种 高效低毒沙虫剂。9、2, 4，5-T，2, 4，5-三氯苯氧乙酸分子式：C8H5O3Cl3分子量：255.5性质:与2,4-D相似。用途：与2, 4-D相似。9、吲唑酯，吲熟酯，IZAA,丰果乐，乙基-5-氯-1H-3-吲哚基醋酸酯分子式：C11H11N2O2C1分子量：238.6性质：纯品为白色针状结晶，有杂质存在时褐色。难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，遇碱 易分解。用途：疏花疏果、促进柑橘果实成熟和改善品质。（二）赤霉素类，GA，现已发现108种1、赤霉酸，GA3，是应用

43、最广的种类。工业上由赤霉菌液体发酵生产分子式：C19H22O6分子量：346.4性质:纯品为白色发结晶，工业品为白色粉剂.难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、冰醋酸等有机 溶剂。它的钠钾盐易溶于水。结晶较稳定，溶液易缓慢水解，加热超过50度会逐渐失去活性，在碱性条 件下被中和失效。用途：使茎伸长，部分代替低温长日照，促进叶的扩大和侧枝生长，促进雄花形成，种子发芽，单性结实 和果实形成，储藏保鲜，抑制成熟和衰老，抑制侧芽休眠和地下块茎形成。2、GA1+2； GA4+7； GA4； GA7 国外也有应用的报道（三）细胞分裂素类，CK。已知12种左右1、玉米素分子式：C10H13N5O分子量

44、：255.2性质:难溶于水和有机溶剂，易溶于盐酸中用途:植物组织培养，防衰保鲜2、 激动素，6-糠基腺嘌吟，KT，KN，动力精分子式：C10H9N5O分子量：215.2性质：不溶于水，微溶于乙醇，丁醇，丙酮和乙醚等有机溶剂。能溶于强酸，强碱及冰醋酸。用途：与玉米素相似3、6-苄基腺嘌吟，6-BA，BA，BAP，绿丹分子式：C12H11N5分子量：225.3性质：难溶于水，可溶于酸性或碱性溶液中用途：植物组织培养；提高座果率，促进果实生长；防衰保鲜。4、氯苯甲酸，PBA，SD8839, ACCEL分子式：C17H19N5O分子量:309.4性质：不溶于水，可溶于乙醇等有机溶剂用途：与BA相似，但

45、活性高于BA5、CPPU，4PU-30，KT-30，N-（2-氯-4-毗啶基）-N-苯基脲分子式：C12H10ClN3O分子量：247.68性质:难溶于水，易溶于甲醇，乙醇和丙酮。CPPU为脲类细胞分裂素中活性最强的一种化合物。用途：促进细胞分裂和器官分化，果实肥大，促进叶绿素合成，防止衰老，打破顶端优势，诱导单性结实， 促进着果等。（四）其它1、油菜素内酯分子式：C28H48O6分子量：480性质：易溶于水。是从油菜等花粉中提取的淄体物质。用途：促进细胞分裂和伸长，促进光合作用，提高抗逆性。施用量极微。0.01PPM即可起作用.2、三十烷醇分子式：C30H62O分子量：438性质：不溶于水，

46、溶于乙醚、氯仿、二氯甲烷中。可用氯仿、吐温20 （或80）配成乳油状使用。对光、空气、热和碱均稳定。药效与药品的纯度、颗粒细度有关。加入氯化钙（10-3MOL/L） 后，效果显著且稳定。用途：促进光合作用，改善氮营养，增强抗逆性。二、植物生长延缓剂（一）脱落酸类，ABA，休眠素，脱落酸。已发现6种分子式：C15H20O4分子量：264.3性质:难溶于水，苯和挥发油。可溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯等，也可溶于碳酸氢钠溶液。用途：科学研究（二）乙烯利，EPA，ETHYTEL，ETHEPHON，CEPHA，一试灵，2-氯乙基磷酸分子式：ClC2H4PO（OH）2分子量：144.5性质：纯品为长针状

47、无色结晶，制剂为棕黄色粘稠强酸性液体，在PH3以下比较稳定，PH4以上放出乙烯，乙烯释放速度随温度和PH上升加快。用途：催熟、多开雌花，打破休眠等。（三）其它生长延缓剂1、 矮壮素，CCC，三西，2-氯乙基三甲基氯化铵，氯化氯代胆碱分子式：C5H13NCl2分子量：158性质：纯品为白色结晶，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和苯等。在中性和酸性溶液中稳定，和碱混合加热 分解失效。是赤霉素生物合成抑制剂。用途：使植物矮化，茎加粗，叶色加深。提高植株抗逆性。不易被土壤吸附或微生物分解，可作土壤施用。2、氯化胆碱，（羟乙基）三甲基氯化铵分子式：C4H14ClNO分子量：139.6性质：纯品为无色结晶，吸湿

48、性强，易溶于水。在土壤中易被微生物分解。叶面喷施后易吸收传递到其它 部位。用途：促进根系发达、块茎和块茎高产，也促进光合产物向生殖器官运输，提高农作物产量。3、 丁酰肌，B9，比久，B995, N-二甲基氨基琥珀酰胺酸分子式：C6H12N2O3分子量：160.2性质：易溶于水，在土壤易被微生物分解，在植物体内稳定。用途：抑制生长素和赤霉素的生物合成。使植株矮化，叶绿而厚，增强抗逆性，促进果实着色和延长储藏 期。4、 多效唑，PP333，氯丁唑，（2RS，3RS）-1（4-氯苯基）-4, 4-二甲基-2-（1，2, 4-三唑-1-基）-戊醇-3分子式：C15H20N3OCl分子量:293.5性质

49、:难溶于水，溶于甲醇丙酮.工业品为95%或15%粉剂，溶于水。用途：抑制赤霉素的生物合成，减缓细胞的分裂和伸长。用于抑制植物茎的伸长生长和矮化植物。它也有 抑菌作用，又是杀菌剂。在土壤中的半衰期为6-12个月。5、缩节胺，皮克斯，调节胺，助壮素，健壮素，PIX，1，1-二甲基哌啶嗡氯化物分子式：C7H18ClN分子量：149.7性质：纯品白色结晶，溶于水，不溶于有机溶剂，抑制赤霉素的生物合成。用途：使植株矮化，提高同化能力，促进成熟，增加产量。土壤中易分解，叶面喷施较好。6、调节膦，氨基甲酰基磷酸乙酯铵盐，蔓草膦。DPX-1108等。分子式：C3H11N2O4P分子量：170.1性质：纯品白色

50、结晶，易溶于水，难溶于丙酮等有机溶剂。自身稳定性好，但酸性稀释液易分解。在土壤 中易分解，叶面施。用途：抑制细胞分裂和伸长，用于灌木矮化（尤其是双子叶植物），柑橘整枝和防除杂草等方面。7、氯化膦，福斯方-D，CBBP，PHOSPHON-D分子式：C19H32C13P分子量：397.8性质：易溶于水。在土壤中可长期残留，用于土壤浇灌用途：园林植物造型（矮化）8、 优康唑，S-3307，烯效唑，高效唑，（E）-（对-氯苯基）-2-（1，2, 4-三唑-1-基）-4, 4-二甲 基-1-戊烯-3-醇分子式：C15H18C1N3O分子量：291.5性质：难溶于水，易溶于丙酮、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂。

51、向上传导，所以土壤施用较好。用途：矮化植株，抗倒伏增产，除杂草，杀菌。9、粉锈宁，三唑酮。1-（4-氯苯氧基）-3，3-二甲基-1-（1，2, 4-三唑-1-基）-2-丁酮分子式：C15H16C1N3O分子量:289.5性质：纯品无色结晶。难溶于水，易溶于甲苯和三氯甲烷中。水溶液半衰期仅有10-12小时。用途：杀菌剂兼植物生长延缓剂。延缓植物生长，减少叶面积，增加叶厚，提高抗逆性。提高光 合作用，有利增产。三、植物生长抑制剂1、青鲜素，顺丁烯二酸酰肌，MH马来酰肌，抑芽丹等分子式：C4H4N2O2分子量：112性质:难溶于水，微溶于醇,易溶于冰醋酸，二乙醇胺。其钠、钾、铵盐溶于水。作用与生长素

52、相反，抑制芽的 生长和茎的伸长。它的结构与尿嘧啶相似，阻止核酸的合成。用途：抑制鳞茎和块茎在储藏期间的发芽，控制烟草侧芽生长。2、三碘苯甲酸，TIBA分子式：C7H2O2I3分子量：500.92性质:不溶于水，易溶于乙醇，乙醚，苯,甲苯等，它能阻碍生长素在体内的运输.用途:抑制茎顶端生长，促进腋芽萌发,使植株分枝多，增加花和结实数3、整形素，形态素，2、氯-9-羟基芴-9-羧酸甲酯分子式：C13H8OHCOOH分子量：228.7性质:微溶于水，溶于乙醇丙酮灯。阻碍生长素向下运输，同时能提高生长素氧化酶的活性，使生长素含量 下降。用途：抑制顶端分生组织生长，使植株矮化，促进侧芽发生。4、增甘膦，N-N双（膦酰基甲基）甘氨酸分子式：C4H11NO8P2分子量：263性质：溶于水。抑制植株生长，也抑制酸性转化酶的活性。用途：甘蔗和甜菜的催熟和增糖。影响试管苗继代培养