酶的分离纯化课件

1、第四章 酶的分离纯化及产品成型（1）酶的抽提（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、 膜过滤、层析分离、电泳分离（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型（4）酶纯化过程 的纯度监测本章知识点：第四章 酶的分离纯化及产品成型（1）酶的抽提（4）酶纯化过程一、生物下游加工技术下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标产物成为现实。 大多数酶的回收纯化过程成本约占70%； 医用酶的生产回收过程的成本高达85%； 基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上； 青霉素回收过程成本

2、约占50%； 乙醇的回收过程成本仅占14%。一、生物下游加工技术下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯二、分离纯化的一般流程原料液细胞分离（离心、过滤） 细胞（胞内产物）清液（胞外产物）细胞破碎碎片分离粗分离纯化成品化线路2线路1二、分离纯化的一般流程原料液细胞分离（离心、过滤） 人干扰素、是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌和治疗肝炎等作用。Yonehara等人：醋酸锌盐析离子交换层析硫酸铵盐析铜螯合层析疏水层析凝胶电泳staehelin等人：硫酸铵盐析免疫亲和层析阳离子交换层析（83.0%）（62.7%）（96.2%）（46.0%）（78.3%）（88.9%）共六步，总收率仅为16%仅三步

3、，总收率达81.0% 人干扰素、是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌在实践工作中选择方法时:首先，应对被纯化的酶的理化性质有个比较全面的了解;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶活性为标准。再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件。最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降,酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。酶的分离纯化三、酶分离纯化的基本原则 （一）酶分离纯化包括三个基本环节抽提纯化精制（二）酶分离纯化应注意以下问题1、防止酶变性失活：温度、pH、泡沫、重金属等。2、选择有效的纯化方法。3、酶活性测定与总蛋白质含量测

4、定应贯穿纯化过程的始终。三、酶分离纯化的基本原则抽提纯化精制（二）酶分离纯化应注意以酶的分离纯化第一节 从发酵液制取酶提取液（酶溶液的制备）一、发酵液的预处理目的：降低粘度，便于固液分离方法：（1）加热： 适用于耐热的酶，注意常要加适当的酶保护剂。 （2）加凝聚剂或絮凝剂 （3）调pH值二、固液分离方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取第一节 从发酵液制取酶提取液（酶溶液的制备）一、发酵液的预处三、细胞破碎机械破碎法物理破碎法化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、 Tween等表面活性剂酶促破碎法捣碎法：捣碎机研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等匀浆法：匀浆器

5、温度差破碎法：冻融交替法压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法超声波破碎法自溶法加酶处理G+菌：溶菌酶G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等酵母菌：-葡聚糖酶和溶菌酶霉菌：几丁质酶三、细胞破碎机械破碎法物理破碎法化学破碎法： 甲苯、丙酮、四、抽提（一）抽提方法 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。 四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂（二）抽提过程中的注意事项1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围； 最好远离待抽提酶的等电点。2、温度：通常控制在04左右，尤其是采用有机溶剂提取时。3、抽提液体积（用量） 抽提液的用量一般为含酶原料体积的

6、25倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。四、抽提（一）抽提方法 指在一定的条件下，用适当分离依据的性质分离方法根据分大小、轻重离心分离、凝胶过滤、膜分离根据溶解度大小盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、选择性沉淀、等电点沉淀根据电学性质离子交换层析、电泳分离根据稳定性差异选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法根据亲和作用亲和层析、亲和电泳酶分离纯化方法： 现有的纯化方法，都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物学特性为依据而建立起来的。分离依据的性质分离方法根据分大小、轻重离心分离、凝胶过滤、膜第三节 酶的沉淀分离盐析沉淀法、等

7、电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法一、盐析沉淀法1、原理：2、硫酸铵盐析的优点 优点：在水中溶解度大，溶解的温度系数小； 价廉，便宜； 可保护酶。 缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。第三节 酶的沉淀分离盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀3、盐析操作（1）硫酸铵的饱和度100%（NH4）2SO4 的饱和度（%）=实际浓度饱和浓度0.4S = 40%（饱和度）3、盐析操作（1）硫酸铵的饱和度100%（NH4）2SO4（2）调整盐浓度的方法加饱和（NH4）2SO4 溶液：VV0（S2 - S1）1 - S2=V0 原来溶液的体积V 所需加入饱和硫酸铵的体积S1 原来溶液的硫酸

8、铵饱和度S2 所需达到的硫酸铵饱和度 例：将2升0.2S的硫酸铵溶液提升至0.5S，需加饱和硫酸铵多少升？溶液体积增加多少倍？（2）调整盐浓度的方法加饱和（NH4）2SO4 溶液：VV0加固体（NH4）2SO4 ：WB（S2 - S1）1 AS2=W 将1L饱和度为S1的溶液提高到 S2所要添加的固体硫酸铵克数；A、B 与温度有关的经验常数 例：某酶制剂厂生产15吨蛋白酶发酵液，用硫酸铵进行盐析,要求硫酸铵的饱和度达到40%，计算需要加入固体硫酸铵多少kg?（25）经验常数010202530A0.2710.2810.2900.2940.298B（g/L）514.72525.05536.3454

9、1.24545.88（mol/L）3.093.974.064.104.133680Kg加固体（NH4）2SO4 ：WB（S2 - S1）1 A(25)(25) 当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实验确定。（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。（5）脱盐：超滤、透析或层析。（4）蛋白质浓度：样品液的蛋白

10、质浓度一般控制在2.53.0% 为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。 当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加入饱和硫酸酶的分离纯化（二）等电点沉淀1、原理2、实际操作 与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较大的杂蛋白 。3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。（二）等电点沉淀1、原理2、实际操作 与其他方法一起使（三）有机溶剂沉淀法1、作用原理 去水膜；降低介电常数、破坏氢键。2、注意 低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽快分离。（三）有机溶剂沉淀法1、作用原理2、注意（四）复合物沉淀法1、原理2、常用

11、的复合沉淀剂： 单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。 PAA + 酶 PAA-酶 PAA-酶 PAA + 酶 PAA + 酶 + Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶 PAA- Ca 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAApH6以上（四）复合物沉淀法1、原理2、常用的复合沉淀剂： （五）选择性变性沉淀法1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。 选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。（

12、五）选择性变性沉淀法1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离、提纯或浓缩的新型分离技术。第三节 膜过滤技术在酶分离纯化中的应用 膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。 广泛应用于生物工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。渗出液 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不一、膜分离的类型1、按推动力不同可分为：（1）扩散膜分离：渗透、透析（2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反

13、渗透（3）电位差膜分离：电渗析2、按膜孔径或截留物质的大小：微滤 超滤 纳滤 、电渗析 、透析 反渗透膜孔径大小一、膜分离的类型1、按推动力不同可分为：2、按膜孔径或截留物病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水膜微滤（MF）超滤（UF）纳滤（MF）反渗透滤（RO）灰尘细菌（0.2-2um）（10-200nm）（2nm）（2-10nm）病毒灰尘生物小分子灰尘盐类灰尘水膜微滤（MF）超滤（UF）纳各种膜分离法的原理和应用范围膜分离法截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质应用举例微 滤（MF）0.

14、22um灰尘、细菌微孔滤膜除菌，回收菌超 滤 （UF）10nm200nm生物大分子及以上超滤膜蛋白质、多肽和多糖的回收和浓缩纳 滤（NF）2nm10nm生物小分子及以上纳滤膜脱盐、浓缩反渗透（RO）电荷效应,可用于测定蛋白质的相对分子质量。4、浓度梯度PAGE5、SDSSDS：十二烷基硫酸钠 CH3（CH2）11SO4Na2 在配制凝胶时加入SDS，同时加巯基乙醇，Pr在电泳时，其中的寡聚体Pr解聚为单体（亚基），SDS分子就将每个单体分子表面覆盖起来，使其形成短轴为1.8nm，而长轴各异的SDS亚基复合物，电泳时，他们的表面电荷基本相同，故可因分子长轴大小（即亚基分子大小）差别而分离，换言之

15、，亚基的大小是彼此分离的依据，所以此法可用于测定单体的相对分子质量。5、SDSSDS：十二烷基硫酸钠 CH36、PAGE的一般操作程序配制各种制胶的贮存液准备制胶模具配制铸胶混合液灌注胶液并聚合成凝胶上槽点样通电电泳取出凝胶Pr染色漂洗显带记录计算绘制电泳图谱6、PAGE的一般操作程序配制各种制胶的贮存液准备制胶模具配酶的分离纯化酶的分离纯化 SDS测定蛋白质（亚基）的相对分子质量（Mr）与它们的电泳迁移率（U）之间，存在如下关系： lgMr = lgK - bU 用 lgMr 对 U 作图，只要实验测得，就可用标准曲线法求得未知蛋白质（亚基）的相对分子质量。 实际工作中，常用相对迁移率（用

16、mR 表示）代替 U 作图。mR=蛋白质移动的距离溴酚蓝移动的距离 SDS测定蛋白质（亚基）的相对分子质量（M三、等电点聚焦电泳（IEFisoelectric focusing ）1、等电点聚焦电泳分离Pr原理 等电点聚焦电泳是在电泳介质中加入两性离子载体，电泳时形成由阳极到阴极的连续递增的pH梯度，蛋白质按其电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此分离的电泳技术，无论Pr从正极出发或是从负极出发，都会聚焦在等电点处。2、两性离子载体 各组分的pI值十分接近，在电泳中可以形成连续的pH梯度，常用的商品名为Ampholine，规格有pH3.59.0和精细分级的pH3.55、5

17、9、911的多种商品可供不同的要求使用。三、等电点聚焦电泳（IEFisoelectric focus第五节 酶液的浓缩、结晶、干燥与成型一、稀酶液的浓缩 浓缩是从稀溶液中除去一部分溶剂（水），使其变成浓缩液的工艺。 酶液浓缩的方法很多：如沉淀，低温真空蒸发、超滤等。二、结晶1、结晶的一般原理不饱和溶液饱和溶液过饱和溶液析出沉淀（快）析出结晶（慢）（无排列排队机会）第五节 酶液的浓缩、结晶、干燥与成型一、稀酶液的浓缩二、结晶2、结晶“三步曲”第一步：形成过饱和溶液稍微越过饱和状态，处于介稳 态， 浓缩、降温（少有升温）、调节pH至pI，可使溶 液趋于过饱和。第二步：形成晶核过饱和溶液在一定条件下

18、可形成极微小 的有序排列的固相物，成为后续晶体生长的核心，称 为晶核。振荡、搅拌、快速降温可促使过饱和溶液形 成晶核，有时可投入少量“晶种”微粒。第三步：晶体生长溶质在晶核周边不断有序排列，晶体逐 步长大，控制条件，如缓慢搅拌、适当升温使细小晶 体溶解，溶质到大晶体周围集结生长。2、结晶“三步曲”第一步：形成过饱和溶液稍微越过饱和状态3、结晶条件（1）酶的纯度一般酶纯度应达到50%以上。（2）酶蛋白的浓度对大多数酶来说，蛋白质浓度在 350mg/mL 较好。（3）晶种有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形 成结晶。（4）温度 一般控制在04范围内。（5）pH值一般选择在被结晶酶的pI值附近。

19、3、结晶条件（1）酶的纯度一般酶纯度应达到50%以上。（3、酶结晶的方法 从原理上讲，有（1）盐析法；（2）有机溶剂结晶法；（3）pH值或温度诱导法等。 由以上方法派生的具体方法，有（1）平衡透析法；（2）气相扩散法。3、酶结晶的方法 从原理上讲，有（1）盐析法；（2）有三、固体酶制剂的干燥、成型和保存1、工业上常用于酶制剂干燥的方法 喷雾干燥法：酶液在干燥塔中喷成雾滴，在100高温下，几秒钟内即可脱水而成干粉，高温短时，酶活力损失小。热风干燥：5055的热风吹过湿物料表面带走水分。真空干燥法：边加热边抽真空除去水分。真空冷冻干燥法：先冷冻结冰，再抽真空使水升华而被抽走。三、固体酶制剂的干燥、成型和保存1、工业上常用于酶制剂干燥的2、成型添加剂（1）酶粉粘结剂（2）颗粒酶成型剂（3）酶稳定剂（4）填充剂 主要目的是调节酶活力达到出厂标准。3、药用酶除去热源 除去热源的方法：超滤、凝胶过滤、阴离子交换剂吸附等。2、成型添加剂（1）酶粉粘结剂（2）颗粒酶成型剂（3）酶稳定4、酶产品的保存 尽量低温