肉制品中磷酸盐的测定 核磁共振波谱法-编制说明

1、附件3CCAA团体标准草案编制说明基本信息标准草案名称中文肉制品中磷酸盐的测定核磁共振波谱法英文Determination of phosphates in meat products by nuclear magnetic resonance spectroscopy项目类型制定修订（被修订标准名称及编号：）计划编号2021TB019起止时间2021年12月-2022年12月标准起草单位湖北省食品质量安全监督检验研究院、北京工商大学、北京市食品检验研究院（北京市食品安全监控和风险评估中心）起草组成员江丰、韩智、王会霞、范志勇、张莉、朱松松、张亚珍、龚蕾、张啟恒、夏金涛、陈刚、李玮、张菊、黄宗

2、骞项目调整情况无背景、目的和意义背景磷酸盐是目前世界各国应用最广泛的食品添加剂，广泛应用于肉制品中，有助于提高肉制品的保水性及嫩度。肉制品中广泛使用的有三聚磷酸盐、三偏磷酸盐、焦磷酸盐，三者通常按不同比例混合使用。食品安全国家标准食品添加剂使用标准(GB 2760-2014)规定，在预制肉制品、熟肉制品中磷酸盐(单独或混合使用，以PO43-计)最大使用量为5.0g/kg。目前有关磷酸盐的国家及行业检测标准有薄层层析法、分光光度法及离子色谱法。然而，使用分光光度法需通过消解将磷酸盐全部转换成正磷酸盐再进行测定，无法测定单个离子；离子色谱法易受基质干扰影响，且需要经过多步骤提取及净化，耗费较多时间

3、和试剂；文献方法中，毛细管电泳方法易受到缓冲液浓度、pH、分离电压、温度等各方面因素影响，迁移时间重现性较差；快检试剂盒法虽不需要大型仪器，但准确度低。基于此，建立一种前处理步骤简单、专属性强，测定快速准确的标准检测方法具有现实意义。目的使用定量核磁共振波谱技术实现肉制品中磷酸盐的快速定量测定。意义该标准可为肉制品中磷酸盐的检测提供一种新颖的快速的检测方法，具有广泛的适用性。该标准所列方法不需复杂的提取及净化等前处理过程，可在没有标准品情况下，快速定量测定肉制品中焦磷酸盐、磷酸盐、三偏磷酸盐、三聚磷酸盐的含量。标准主要起草人任务分工湖北省食品质量安全监督检验研究院负责牵头组织，中国农业科学院农

4、业质量标准与检测技术研究所、北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所）、中国认证认可协会等机构分工负责并共同参与起草。主要工作过程标准起草组织工作由湖北省食品质量安全监督检验研究院牵头负责，主要工作为收集整理国内外相关标准和技术资料；制定研究方案、负责分析方法优化建立与验证、样品检验分析；组织标准起草及实验室方法可行性验证，撰写标准文本和编制说明。简要工作进程如下：项目调研2021年11月1日，查阅大量国内外核磁共振定量检测技术方法和标准，对各方法的原理及特点进行对比分析，确定研究方案，同时进行标准的预研究工作。项目立项2021年11月15日，项目立项。起草阶段2021年11月，各实

5、验小组开展各部分实验工作，定期开展工作总结；2021年12月，对标准建立方法学实验部分汇总，形成标准内容初稿；2022年1月-7月，各小组对初稿进行评审，对实验数据进行总结补充，对文本就行修改完善，形成标准草案。征求意见阶段2022年9月，标准公开征求意见。标准完善阶段2022年10月-2022年12月。标准编制原则和确定标准主要内容的论据标准编制原则本标准为首次制定，以科学的实验数据为依据，经过科学研究而制定。本标准旨在利用定量核磁共振波谱技术实现肉制品中磷酸盐的快速定量检测。本标准不仅是GB 5009.256-2016食品安全国家标准食品中多种磷酸盐的测定的有效补充，同时对其进行了改进，不

6、需要复杂的提取及净化等前处理过程，能快速测定肉制品中焦磷酸盐、磷酸盐、三偏磷酸盐、三聚磷酸盐的含量，提供一种新颖的快速的检测方法，具有广泛的适用性。同时，本方法在编制过程中引入第三方实验室对本标准所列方法进行验证和评价，具有先进性、科学性、合理性和可操作性。确定标准主要内容的论据本标准拟采用使用31P-NMR定量检测肉制品中磷酸盐含量，分别对提取试剂、净化方式等前处理条件和内标物的选择、延迟时间（D1）等仪器条件进行优化，再通过对所建方法进行方法学考察，计算方法的检出限、回收率和精密度，建立定量核磁共振波谱法测定肉制品中磷酸盐的方法，以扩充当前肉制品中磷酸盐的检测需求。一、前处理方法及仪器条件

7、的确立1、提取溶剂的确定本实验以1.0 mg/mL的焦磷酸钠为例，比较了其在pH=4.5醋酸缓冲盐、pH=7.0的超纯水、pH=9.0的硼酸缓冲盐下的化学位移(, ppm)，分别为=-9.40 ppm、=-7.4 ppm、=-6.50 ppm，实验结果显示pH值越大，其化学位移越大。在实际样品中，相同磷酸盐的化学位移会因为pH值不同而导致化学位移变化，从而造成峰归属分类错误，因此不适合使用水去提取磷酸盐，而需采用缓冲盐提取。由于磷酸盐在酸性条件下容易发生水解，因此本实验最后选择pH=9.0的硼酸缓冲盐保持样品提取溶液pH值稳定，进行磷酸盐提取。本实验还以焦磷酸钠和焦磷酸钾为例，比较了钠盐和钾盐

8、的化学位移，在相同pH值下，其化学位移相同。2、净化方式的选择肉制品中含有丰富的脂肪、蛋白质等，使用离子色谱法测定磷酸盐中需要采取净化的策略沉淀去除干扰物质，一般方法采用固相萃取净化小柱或有机试剂CHCl3净化提取液。本实验以火腿肠为基质，比较了C18固相萃取、Ag/H固相萃取小柱、CHCl3有机试剂沉淀3种净化方式及直接离心过膜上机共4种方法对磷酸盐测定含量的影响，结果表明使用核磁共振波谱仪，4种方法测得的结果无显著性差异，说明31P-NMR在测定磷酸盐时，抗干扰能力强，无需复杂前处理即可进行测定。3、内标物的选择用于定量核磁的理想内标应满足以下条件：内标的定量峰与待测样品的定量峰分离良好，

9、易溶于测试溶剂，不与待测样品相互作用。在定量磷谱中，常见的内标物有磷酸氢二钾、六甲基磷酰三胺（HMPA）、亚甲基二磷酸、磷酸三苯酯、三苯基膦等。实验表明不同磷酸盐的化学位移分布在5.0 ppm-25.0 ppm。本实验参考相关文献，选取HMPA为内标，其化学位移为29.91 ppm（使用H3PO3为基点进行校准），与各目标化合物分离度好。4、延迟时间（D1）及定量方式的确定一般定量核磁推荐D15T1，本实验采用Bruker标准序列t1irpg，使用标准程序测试了各磷酸盐的T1（各磷酸盐的T1见表1），T1为1.59-10.63 s。依据D15T1，D1应最少应该设为54 s，但是过大的D1会导

10、致单次扫描时间增加，分析目标物的所耗费时间显著加长。有学者在测定蔬菜中羟乙磷酸时，认为D1不必大于5T1，最终经过优化后，将D1设为0.05 s进行定量分析。本实验参考文献方法将D1设为0.1s，NS设为512，扫描时间为17 min 34s，配制4种磷酸盐（以阴离子根计）的混合标准曲线为40、100、300、500、800、1000、1500、2000 g/mL。分别以3种方法验证方法的可行性。表1 各化合物的弛豫时间（T1）化合物名称化学位移（ppm）T1（s）PO43-2.5910.63P3O93-21.512.43P2O74-6.513.72P3O105-5.66-5.582.35-2

11、0.43-20.271.59HMPA29.918.59方法：以4种磷酸盐定量峰信号强度为纵坐标y，以浓度为横坐标x，进行线性回归绘制曲线。方法：以4种磷酸盐与内标物定量峰的信号强度比为纵坐标y，以4种磷酸盐与内标物浓度比为横坐标x轴，进行线性回归绘制曲线。方法使用内标绝对测定法，利用HMPA的峰面积和质量计算出其它4种磷酸盐的含量。实验结果表明使用和时，y与x均成线性，且相关系数R20.999，但使用方法的HMPA峰面积计算PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-的含量时，计算含量分别为实际含量的104.1%、155.2%、215.36%、182.1%，与实际含量偏差大。分析原因

12、可能是因为各化合物的T1不同，过短的D1导致T1值大的化合物中的P原子未回到初始状态，能量释放不充分，导致不同化学位移的原子信号响应不同。实验测试了相同扫描次数下，D1分别为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、12、14、16、18、20、25、30、50、60 s时各化合物的响应强度，实验结果表明当D1在0.112s时，信号逐渐增强，但在12 s后信号无显著性差异（P0.05），因此最终选择D1为12 s，最后采集参数为，采样点数TD：65 536，扫描次数NS=64，延迟时间D1=12 s，采集时间AQ=1.9268 s，谱宽SW=70 ppm，O1P=5 ppm，O2P=4.7

13、 ppm，P1=12 s，增益RG=203，测定温度298 K，单个样品测试耗时14 min 53 s。5、优化后的方法概述a.主要仪器与设备核磁共振波谱仪（可控温，温度精度不低于0.1 K；配备5 mm二合一宽带液体探头）；食物粉碎机；电子天平（感量分别为0.0001 g和0.01 g）；旋振荡器（转速2 000 rpm）；离心机（转速12 000 r/min，温度可调到4 及以下）；pH计（精度为0.01）;移液器（量程为10 L100 L和100 L1000 L。）b.碱性缓冲液配制600 mL硼酸-氯化钾缓冲液（pH=9.0），加入300 mL0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH

14、=9.0），混匀。c.测定步骤称取5.0 g试样至50mL聚丙烯离心管中，加入碱性缓冲液10 mL，用涡旋振荡器振荡混匀2 min，在4下12 000 r/min离心10 min，收集上清液，用10 mL碱性缓冲液重复提取一次，合并两次上清液，转移到25 mL具塞比色管中，加入500 L浓度为50 mg/mLHMPA标准溶液，用碱性缓冲液定容到25 mL，取23 mL澄清液体过0.45 m微孔滤膜，为待测液。d.核磁共振波谱参考条件测定温度：（2980.1）K；采样点数（TD）：65 536；扫描次数（NS）：64；延迟时间（D1）：12 s；采集时间（AQ）：1.9268 s；增益（RG）：

15、203；脉冲序列：氢去耦的一维磷谱脉冲序列。e.试样测定用移液枪精密移取450 L待测液至5 mm标准核磁管中，精密移取50 L重水于核磁管中，将二者混匀，进行上机测试。f.数据预处理采用线宽因子为0.3 Hz的窗函数对原始的自由感应衰减信号进行傅里叶变换得到频域谱，然后进行自动相位校正及基线平滑。g.定性分析如果试样图谱中存在化学位移与表2某种组分一致（变化范围在5.0%之内），则可判定试样中存在该组分。表2不同磷酸根及内标参考化学位移表化合物名称化学位移（ppm）磷酸根2.59焦磷酸根-6.51三偏磷酸根-21.51三聚磷酸根-5.66-5.58-20.43-20.27六甲基磷酰三胺29.

16、91h.定量峰积分根据定性分析结果，进行定量峰的积分，分别得到各磷酸根和内标六甲基磷酰三胺定量峰积分面积。i.结果计算试样中磷酸根含量按式（1）计算：（1）式中：试样中PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-含量，单位为克每千克（g/kg）；样品称样量，单位为克（g）；25.0 mL试样提取液中含有六甲基磷酰三胺的质量，单位为毫克（mg）；PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）；六甲基磷酰三胺摩尔质量，为179.2 g/mol；上机样品中PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-定量峰积分面积；上机样品中六甲基磷酰

17、三胺定量峰积分面积；上机样品中PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-积分区域对应的磷原子数量，PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-分别计为1、3、2、3；上机样品中六甲基磷酰三胺积分区域对应的磷原子数量，计为1。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留至小数点后两位。二、方法学考察1、精密度分析采用HMPA内标法测定肉制品中磷酸盐的日内精密度为0.68% 3.55%，日间精密度为1.12%4.51%，且日内与日间磷酸盐测定结果无显著性差异，方法精密度高。2、回收率实验往基质中添加高中低三水平的磷酸盐，每个水平平行测定6次，计算回收

18、率和相对标准偏差。结果如表3所示，采用HMPA内标法测定肉制品中磷酸盐的回收率为97.0%112.0%，RSD为0.87%3.15%。表3加标回收率及相对标准偏差化合物名称基质含量(g/kg)添加水平（g/kg）实测含量（g/kg）回收率（%）RSD（%）PO43-2.680.503.21106.02.132.004.6297.01.155.007.5898.01.56P3O93-00.500.55110.03.112.001.9899.02.185.005.28105.60.96P3O105-00.500.56112.03.152.002.08104.02.655.004.9298.42.1

19、4P2O74-0.480.500.52104.01.682.002.21110.50.985.005.11102.20.873、检出限以信噪比S/N2确定检出限。PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-的检出限分别为0.15、0.15、0.15、0.30 g/kg。4、方法比对使用核磁共振方法和离子色谱法分别对10个实际样品进行含量测试，结果如表4所示，两种检测方法的含量无显著性差异，进一步验证31P-NMR方法准确、可靠。结果也表明在肉制品中磷酸盐含量普遍较高。表4不同检测方法的含量对比样品编号样品中各离子的含量（g/kg）PO43-P2O74-P3O93-P3O105-14.

20、55a/4.83b0.80a/0.87b0a/0b0a/0b24.91a/4.53b0.16a/0.15b0a/0b0a/0b30.62a/0.59b0a/0b0a/0b0a/0b43.90a/3.54b0.84a/0.78b0a/0b0a/0b54.95a/4.67b1.66a/1.56b0a/0b0a/0b62.68a/2.93b0.49a/0.52b0a/0b0a/0b73.34a/3.02 b0.88a/0.80b0a/0b0a/0b83.54a/3.96b0.62a/0.69b0a/0b0a/0b94.72a/4.65b1.38a/1.42b0a/0b0a/0b103.50a/3.34b0.61a/0.59b0a/0b0a/0b注：a为核磁共振法结果，b为离子色谱法结果三、实验室间协同试验结果本方法