DB34-T 4268-2022发酵茶中B族和G族黄曲霉毒素的测定

1、ICS67.140CCSX 55ICS67.140CCSX 55安徽省地方标准DB34/T42682022发酵茶中B 族和G 族黄曲霉毒素的测定Determination of aflatoxin B and G groups in fermented tea20222022083120220930安徽省市场监督管理局发 布前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件主要起草人：周育、管道健、张海柱、唐蜀昆、张梁、王希春。 发酵茶中 B 族和 G 族黄曲霉毒素的测定范围BBG12AFB2、AFG1

2、和AFG2）的测定方法。 以下简称AFB1、AFB1AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。 本文件第二法为双柱净化-液相色谱柱串联质谱法，适用于发酵茶中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。 （ GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 5009.22 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定 3 术语和定义3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。 4 第一法 双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法原理AFB1AFB2AFG1 试剂及材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.2.1 试 剂4.2.1.1

3、 甲醇（CH3OH，CAS：67-56-1） 4.2.1.2 乙腈（CH3CN，CAS：75-05-8） 4.2.1.3 （NaCl，CAS：7647-14-5） 4.2.1.4 （Na2HPO4，CAS：7558-79-4） 4.2.1.5 （KH2PO4，CAS：7778-77-0） 4.2.1.6 （KCl，CAS：7447-40-7） 4.2.1.7 盐酸（HCl，CAS：7647-01-0） 4.2.1.8 吐温-20（C58H114O26，CAS：9005-64-5） 4.2.1.9 （MgSO4，CAS：7487-88-9） 4.2.1.10 （PVP，CAS：9003-39-8

4、） 4.2.1.11 N-（PSA，CAS：111-39-7） 材料1mL5mL 100 mL 1.6 m 。 AFB1 200 ng，AFB180%，AFG280 0.22 m 4.2.3.1 （84+16）：取 840 mL160 mL 4.2.3.2 （70+30）：取 700 mL300 mL 4.2.3.3 （PBS）：称取 8.00 g 氯化钠、1.20 g0.20 g 磷0.20 g900 mLpH 至 1000 mL 4.2.3.4 含 1%-20PBS：取 10 mL20，用 PBS1000 mL 标准品 AFB1AFB2AFG1 和AFG2 1 0.01 100 mL10

5、g/mL205009.22 （AFB1AFG1100g/L，AFB2AFG225g /L)移液管准确移取AFB1和AFG1标准储备溶液各 1 mL，AFB2和AFG2标准储备溶液各 250 L 至 100 mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光 -20 下保存，一个月内有效。 仪器和设备 4.3.3 0.01 g0.00001 4.3.4 4.3.5 6000 。 15 mL-50 mL 1 mm2mm 分析步骤取样茶汤采样量需大于 1 L，将所有液体样品在一个容器中混匀后，取其中任意的 100 mL 样品，供检测用。 干茶采样量需大于 1.0 2 100 g 提取茶汤取 50 mL 试样（精确至

6、 0.01 mL），然后加入 50 mL 乙腈（精确至 0.01 mL），7.5 g 氯化钠（精确至 0.01g），涡旋 1 min，6000 g 离心 10 min，取上清液，再加入 50 mL 乙腈重复提取， 然后合并两次上清液，并加入 2 g 氯化钠（精确至 0.01 g），2 g 硫酸镁（精确至 0.01 g），5 g PVP（精确至0.01 g），2 g PSA（精确至0.01 g），6000 g 离心 10 min，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，收取虑液备用。 干茶称取 5 g（0.01g）于 50 mL25 mL（4.2.3.1）或甲（4.2.3.2）20 min，（6000 下离心

7、 min 净化移取适量上清液，按多功能净化柱的操作说明进行净化，收集全部净化液，并确保净化液多于 4 mL。 用刻度移液管准确吸取上步的净化液 4 mL （茶汤样品 20 mL 或依据浓度适当调整），加入 46 mL 含 1% 吐温 -20 的PBS（使用甲醇-水溶液作为黄曲霉毒素提取溶剂时，加入含 1% 吐温 -20 的PBS可减半加入），混匀。 将 2 6 条件下保存的免疫亲和柱从冷藏条件下取出，恢复至室温连接于固相萃取装置。 和柱下部放置 5 mL 刻度试管，加入 2 mL 甲醇，以每秒1滴的速度洗脱免疫亲和柱，再用空气压力泵吹干免疫亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在 50 条件下，用氮

8、气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0 mL 甲醇-水溶液（45:55，V/V），涡旋 30 秒溶解残留物，过 0.22 m 有机滤膜过滤，收集滤液待测。 高效液相色谱参考条件如下： AB A55%；B45%； C18和柱下部放置 5 mL 刻度试管，加入 2 mL 甲醇，以每秒1滴的速度洗脱免疫亲和柱，再用空气压力泵吹干免疫亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在 50 条件下，用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0 mL 甲醇-水溶液（45:55，V/V），涡旋 30 秒溶解残留物，过 0.22 m 有机滤膜过滤，收集滤液待测。 高效液相色谱参考条件如下： AB A55%；B45%； C18（2

9、50mm150mm4.6 mm5 m)流速：0.8mL/min； e) 柱温：40； 10 360nm440nm；A。试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准品色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在 2.5% 之内。 在4.4.4AFB1AFB2AFG1和AFG2 0.99。 4.4.7 空白试验 AFB1AFB2AFG1和AFG2（1）（g/kg 或 g/L） = 1000(0) (1) 1000式中：C 试样中AFB1、AFB2、AFG1或AFG2的含量，单位为微克每千克或微克每升（g/kg或g/L）； 标准工作液中黄曲霉毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； A 样液中黄曲霉毒素的

10、峰面积； A0 V（mL）； m （g或AS 精密度在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值，不得超过算术平均值的 20%。 检测限当称取样品 g（50 mL）AFB1的检出限为 0.04 g/kg（或g/L），AFB2的检出限为 0.02 或0.04 的检出限为 0.02 或 5 第二法 双柱净化-液相色谱柱串联质谱检测法 原理AFB1AFB2、AFG1、AFG21% 吐温 -20 试剂同4.2.1。 材料同4.2.2。 同4.2.3。 标准品同4.2.4。 同4.2.5。 5.3.3 0.01 g0.00001 g 5.3.6 6000 g 15 mL50 mL 筛网：1 mm m

11、m分析步骤取样同4.4.1。分析步骤取样同4.4.1。 提取同4.4.2。 净化同4.4.3。 高效液相色谱参考条件如下： AB b) 梯度洗脱：95% A 相（0 min5 min），95%35% A 相（5 min7.5 min），95% A 相（7.5 min10 min）； C18（100mm2.1 mm1.7 m）流速：0.4mL/min； e) 柱温：25； f) 进样体积：1.0 L。 5.4.5 质谱参考条件质谱参考条件列出如下： （MRM）； V； 12050 L/h，500L/h650V； 1M313/269； AFB2315/259287；AFG1329/243331/2

12、85245； 1B； C 2.5% 之内。 5020%；相对离子丰度 20%50偏差 25%；相对离子丰度 10%20%，允许相对偏差 30%；相对离子丰度 1050%）。 在5.4.4和5.4.5的液相色谱串联质谱仪分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以AFB1AFB2AFG1和AFG2 取5.4.35.5 5.4.15.4.8 分析结果计算与表述AFB1AFB2AFG1和AFG2（g/kg或g/L） = 1000(0) (2) 1000式中：C 试样中AFB1、AFB2、AFG1或AFG2的含量，单位为微克每千克或微克每升（g/kg或g/L）； 标准工作液中黄曲霉毒素的浓度，单

13、位为纳克每毫升(ng/mL)； A 样液中黄曲霉毒素的峰面积； A0 V（mL）； m （g或AS 精密度在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 20%。 检测限当称取样品 5g（或 50 mL）AFB1的检出限为 0.02 g/kg（或g/L），AFB2的检出限为 0.05 g/kg（或g/L），AFG1的检出限为 0.1 g/kg（g/L），AFG20.21 g/kg（或g/L） 附 录 A（资料性）黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2 液相色谱图A1为四种黄曲霉毒素添加回收样品色谱峰；A2为四种黄曲霉毒素标准品色谱峰。 图A.1 黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2 液相色谱图附 录 B（资料性）黄曲霉毒素 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2 总离子流扫描图B1为