血清清蛋白γ球蛋白分离提纯及鉴定医学第六实验室

1、文档编码 : CV6R1O1O5A10 HW1Z8J10N3E7 ZD6L10L10N2I8生物化学试验报告姓 名：学 号：专业年级：组别：第六试验室生物化学与分子生物学试验教学中心第 1 页,共 18 页一,试验室规章1试验前应认真预习试验指导,明确试验目的和要求,写出预试验报告；2进入试验室必需穿白外套；严格遵守试验课纪律,不得无故迟到或早退；不得高声说话；严禁拿试验器具开玩笑；试验室内禁止吸烟,用餐；3严格按操作规程进行试验；试验过程中自己不能解决或预备的问题,切勿盲目处理,应准时请教指导老师；4严格按操作规程使用仪器,凡不熟识操作方法的仪器不得任凭动用,对珍贵的精密仪器必需先熟知使用方

2、法,闭电源并报告老师,不得擅自拆修；才能开头使用；仪器发生故障,应立刻关5取用试剂时必需“随开随盖” ,“盖随瓶走”,即用毕立刻盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,防止污染；6疼惜公物,节省水,电,试剂,遵守损坏仪器报告,登记,赔偿制度；7留意水,电,试剂的使用安全；使用易燃易爆物品时应远离火源；用试 管加热时,管口不准对人；严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上；任何时候不得将强酸,强碱,高温,有毒物质抛洒在试验台上；8废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内；废弃液体如为强 酸强碱,必需事先用水稀释,方可倒入水槽内,并放水冲走；9以实事求是的科学态度照实记录试验结果,认真分析,做出

3、客观结论；试验失败,须认真查找缘由,而不能任意涂改试验结果；试验完毕,认真书写实验报告,按时上交；10试验完毕,个人应将试剂,仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗 洁净归置好,方可离开试验室；值日生就要认真负责整个试验室的清洁和整理,保持试验洁净卫生；离开试验室前检查电源,水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度；第 2 页,共 18 页二,试验报告的基本要求试验报告通过分析总结试验的结果和问题,加深对有关理论和技术的懂得与 把握,提高分析,综合,概括问题的才能,同时也是学习撰写争论论文的过程；1试验报告应当在专用的生化试验报告本上,按上述格式要求书写；2试验报告的前三部分试验原理,试验

4、材料（包括试验样品,主要试 剂,主要仪器与器材）,试验步骤（包括试验流程与操作步骤）要求在试验课前预习后撰写,作为试验预习报告的内容；预习时也要考虑并设计好相应试验记录的表格；3每项内容的基本要求（1）试验原理：简明扼要地写出试验的原理,涉及化学反应时用化学反应方程式表示；（2）试验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪器；说明化学 试剂时要防止使用未被普遍接受的商品名和俗名；试剂要标清所用的浓度；（3）试验步骤：描述要简洁,不能照抄试验讲义,可以接受工艺流程图的 方式或自行设计的表格来表示,但对试验条件和操作的关键环节应写清晰,以便他人重复；（4）试验记录：包括主要试验条件,试验中观看

5、到的现象及试验中的原始 数据；（5）结果（定量试验包括运算）：应把所得的试验结果（如观看现象）和数 据进行整理,归纳,分析,对比,尽量用图表的形式概括试验的结果,照试验组 与对比组试验结果的比较表等有时对试验结果仍可附以必要的说明 ；（6）争论：不应是试验结果的重述,而是以结果为基础的规律推论；如对 定性试验,在分析试验结果的基础上应有中肯的结论；仍可以包括关于试验方法,操作技术和有关试验的一些问题,对试验反常结果的分析和评论,对于试验设计的熟识,体会和建议,对试验课的改进看法等；（7）结论：一般试验要有结论,结论要简洁扼要,说明本次试验所获得的 结果；第 3 页,共 18 页三,试验报告的评

6、分标准（百分制）1试验预习报告内容（30 分）同学进入试验室前应预习试验,并书写预习报告；试验预习报告应包括以下三部分：试验原理（10 分）：要求以自己的语言归纳要点；试验材料（5 分）：包括样品,试剂及仪器；只列出主要仪器,试剂（常规材料不列）；试验方法（15 分）：包括流程或路线,操作步骤,要以流程图,表格式给出要点,简明扼要；依据各部分内容是否完整,清晰,简明等,分以下三个等级给分；优秀合格不合格3025 2418 分170 分优秀：项目完整,能反映试验者的加工,整理,提炼；合格：较完整,有确定整理,但不够精炼；不合格：不完整,缺项,大段文字,完全照抄教材,记流水账；试验预习报告不合格者

7、,不答应进行试验；该试验应重新预约,待试验室支配时间后方可进行 试验；2试验记录内容（20 分）试验记录是试验教学,科学争论的重要环节之一,必需培育严谨的科学作风；试验记录的主要内容包括以下三方面：主要试验条件（如材料的来源,质量；试剂的规格,用量,浓度；试验时间,操作要点中的技巧,失误等,以便总结试验时进行核对和作为查找成败原 因的参考依据）；试验中观看到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；原始试验数据：设计 试验数据表格（留意三线表格式）,精确记录试验中测得的原始数据；记录测量值时,要依据仪器的 精确度精确记录有效数字（如吸光值为,不应写成 5）,留意有效数字的位数；试验记录应在试验过程

8、中书写；应当用钢笔或者圆珠笔记录,不能用铅笔；记录不行擦抹和涂 改,写错时可以精确划去重记；记录数据时请老师审核并签名；试验记录分以下三个等级给分；优秀合格不合格2017 1613 分120 分优秀：照实具体地记录了试验条件,试验中观看到的现象,结果及试验中的原始数据（如三次 测定的吸光度值）等；试验记录用钢笔或者圆珠笔记录,没有抹擦和涂改迹象；书写精确,表格规 范（三线表）；有老师的签字审核；合格：记录了主要试验条件,但不具体,凌乱；试验中观看到的现象不细致；原始数据无涂改 迹象,但不规范；有老师的签字审核；第 4 页,共 18 页不合格：记录不完整,有遗漏；原始数据有抹擦和涂改迹象,捏造数

9、据（以 0 分计）；图,表格 形式错误；用铅笔记录原始数据；无老师的签字审核；如记录的结果有怀疑,遗漏,丢失,必需重做试验,培育严谨的科学作风；3结果与争论（45 分）（1）数据处理（5 分）对试验中所测得的一系列数值,要挑选合适的处理方法进行整理和分析；数据处理时,要依据运算公式正确书写中间运算过程或推导过程及结果,得出最终试验结果；要留意有效数字的位数,单位（国际单位制）；经过统计处理的数据要以X SD 表示；可分成以下三个等级给分；优秀合格不合格5 分4 分30 分优秀：处理方法合理,中间过程清晰,数据格式单位规范；合格：处理方法较合理,有中间运算过程；数据格式单位较规范；不合格：处理方

10、法不当；无中间过程；有效数字的位数,单位不规范；（2）结果（20 分）试验结果部分应把所观看到的现象和处理的最终数据进行归纳,分析,比对,以列表法或作图法来表示；同时对结果仍可附以必要的说明；要留意图表的规范：表格要有编号,标题；表格中数据要有单位（通常列在每一列顶端的第一 行或每一行左端的第一列）；图也要有编号,标题,标注在图的下方；直角坐标图的纵轴和横轴要标 出方向,名称,单位和长度单位；电泳图谱和层析图谱等要标明正,负极方向及分别出的区带,色 带或色斑的组分或成分；电泳结果仍要标记泳道,并在图题下给出泳道的注释；要标出分子量标准 的各条带的大小；并且留意需要结合图表对结果进行较具体的说明

11、说明；可分成以下三个等级给分；优秀合格不合格2017 1613 分120 分优秀：试验结果有归纳,说明说明,结果精确,格式规范；合格：堆砌试验现象,数据,说明说明少；不合格：最终试验结果错误且无说明说明,图表,数字不规范；（3）争论（20 分）争论应环绕试验结果进行,不是试验结果的重述,而是以试验结果为基础的规律推论,基本内 容包括：用已有的专业学问理论对试验结果进行争论,从理论上对试验结果的各种资料,数据,现象等进行综合分析,说明,说明试验结果,重点阐述试验中显现的一般规律与特殊性规律之间的第 5 页,共 18 页关系；试验结果提示了哪些新问题,指出结果与结论的理论意义及其大小；对实践的指导

12、与应 用价值；试验中遇到的问题,差错和教训,与预想不一样的缘由,有何待解决的方法,提出在今 后的试验中需要留意和改进的地方；试验目的是否达到；同时能结合查阅的其他文献等资料进行争论,有独到的见解；在试验结果和理论分析的基础上,经过推理,归纳规律得出结论；结论要严谨,精炼,表达要精确,与试验目的呼应；也分三个等级 给分；优秀合格不合格2017 1613 分120 分优秀：分析试验结果的问题与体会；分析试验设计的优劣；能提出试验技术,方法的改进看法；能结合自己查阅的其他资料来争论,有自己独到的见解；有结论；合格：仅针对试验结果进行争论,有确定自己的见解；不合格：将争论写成留意事项分析或回答摸索题等

13、,与试验结果无关；4格式与版面（5 分）依据试验报告的书写格式,版面是否洁净,工整,分三个等级给分；优秀合格不合格5 分4 分30 分优秀：试验报告字体工整,版面洁净；合格：试验报告字体较工整,版面较洁净；不合格：试验报告字体潦草,版面凌乱；5. 加分（510 分）：以全英文书写试验报告视情形加 510 分；第 6 页,共 18 页Introduction to Biochemistry ExperimentBiochemistry experiment is a preclinical curriculum of omni-specialties in biomedicine and an

14、experimental curriculum for going with biochemistry teaching. Its task is to help students to understand and master the basic technical principles and methods in biochemistry, to possessthe abilities of analyzing problems and working out solutions independently. By learning this curriculum, the stud

15、ents should understand the basic experimental principles of spectrophotometry,chromatography, electrophoresis and centrifugee, t al.,master the basic technical skills commonly used with these principles and possessthe abilities to apply the skills systematically and to optimize the experiment condit

16、ions. The goal of biochemistry experiment is to make the students strengthen their grasp of the biochemistry theories and to integrate what they have learned with scientific research and clinical application. There are 9 experiments that represent most important areas of biochemistry including chara

17、cterization of proteins and nucleic acid by electrophoresis and spectroscopic or chromatographic analysis. These experiments are essential for a typical one-semester course and are to be revised and updated when necessary. New experiments will be added to this list in the future to cover more topics

18、 of biochemistry and to reflect the many advancesin biochemistry. Biochemistry Laboratory Rules1Pre-Laboratory PreparationAll students must prepare BEFOREARRIVINGINTHELABORATORY . The experimentsaredesignedso that they canbecarriedout withproperadvanceplanning within the four-hour laboratory periods

19、. It is expected that students should have a fundamentalunderstanding of the theoryandpracticespertaining to the experimebnteforeentering the laboratory to conduct these experiments. Biochemical experiments often employ toxic chemica.ls For the health and safety of all students, the experimental pro

20、tocols must be studied and the day shouldbe s activitiesplanned in advance. If it becomes obvious that a student is ill-prepared, he or she will not be permitted to continue the experiment. 2Safety Precautions in the Biochemistry Laboratory第 7 页,共 18 页All INJURIES, no matter how minor, should be rep

21、orted to the instructor IMMEDIATELY. If you have any questions regarding the safe handling of any biochemical, consult your instructor. 3Strictly follow the experimental procedures.Turn to instructors immediately for help once the laboratory instruments don twork. DON T try to fix the breakdownby yo

22、urself. your own fault will be demanded. 4Disposal of SolutionsProper compensation for loss because of In most cases the solutions used during the laboratory can be disposed of as directed by laboratory personnel at the end of the period. Any volatile organic solvents should be placed in the hood as

23、 directed. Laboratory personnel will then dispose of these solvents. 5Solid trashes including waste papers are prohibited to discard into the sink. 6All the glassware should be cleaned immediately after use. And all the reagent bottles and instruments should be placed neatly after use. 7An experimen

24、t report should be submitted to the Professor and/or TAs in time. Laboratory Report1Although students will work in pairs for all experiments, each student must turn in anindividual laboratory report, written by himself or herself . These reports should be clearly written in ink, typed, or printed an

25、d be clear and legible. If mistakes are made, neatly cross them out and enter the corrections nearby. Reports should be written in the third person e.g., do not use “ I ” orST“AwPeL”E.a Title Page to the top of the reportand STAPLE the accompanying graphs, tables, and laboratory notebook sheetsto th

26、e back. If the report is not clearly presented,the instructor may return the report without grading it.2Each laboratory report should consist of: 第 8 页,共 18 页a. Title Page A title page for each experiment is required and should state the title of the experiment, the name of the student, the dates of

27、 the laboratory periods covered, the names of the laboratory partners, and the date that the laboratory report is due. b. Objectives Statement of the point of the experiment - in no more than two sentences. c. Procedures DO NOT recapitulate the laboratory protocol. Write in you OWN words. A clear fl

28、owchart of the procedures is recommended. d. Results This section should summarize your observations presentedin the form of graphs, calculations, tables, etc. e. Discussion Evaluate your data. Explain what you observed and also why you think the data were as observed. Do not restate procedures. Lis

29、t possible sites of error . Whenever possible demonstrate your understanding of the theory behind the experiment. Support your results e.g.: “ Using the linear portion of the Absorbance vs. Concentration graph to calculate the slope, it was determined that. ed to ” L only one page per experiment for

30、 experiments 1 - 6 and four pages for experiment 7-9. 3If any laboratory report is not completed and turned in by the end of the quarter, the student maybe receive an Incomplete for the course at the discretion of the instructors; alternatively a “ zero ” for the missing laboratory report will be re

31、corded and the final grade determined accordingly. 第 9 页,共 18 页试验名称血清清蛋白, - 球蛋白的分别,提纯与Title of 鉴定试验地点Experimetn试验日期2022-12-13 Date of 第六试验室Lab No.Experiment合作者老师签名指导老师PartnerInstructor总分批改日期Total Score SignatureDate【试验报告第一部分（预习报告内容）：试验原理,试验材料（包括试验样品,主要试剂,主要仪器与器材）,试验步骤（包括试验流程,操作步骤和留意事项）；评分（满分30分）：XX

32、】1,试验原理：蛋白质的分别和纯化是争论蛋白质化学及其生物学功能的重要手段；不同蛋白质的分子量,溶解度及等电点等都有所不同；利用这些性质 的差别,可分别纯化各种蛋白质；2,试验材料：药品：人血清,葡聚糖凝胶G-25Sephadex G-25层析柱,二乙基氨基乙基DEAE 纤维素离子交换层析柱,饱和硫酸铵溶液,各不同浓度的醋酸铵溶液,20%磺 基水杨酸,1%BaCl2 溶液；仪器：电泳仪,电泳槽 试验步骤：试验流程：粗提 脱盐 纯化 鉴定 操作步骤：步骤操作,混匀室温放置盐析粗提取血清,边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液10min,4000r/min 离心10min；凝胶柱层析除盐1,沉淀（含球蛋白）

33、加水7,上清液（含清蛋白,少量 球第 10 页,共 18 页溶解；蛋白和 球蛋白）约；2,过葡聚糖凝胶G-25 层析柱（8,过葡聚糖凝胶G-25 层析柱（ 7cm）7cm）3,用缓冲 9,用1ml 0.02mol/L NH4AC 缓冲液清洗层析柱内壁, 连续用液清洗层析柱内壁, 连续用缓冲液 0.02mol/L pH6.5 NH4AC 缓冲液2ml 洗脱,流出液量约1ml 时开 始检测蛋白质；（磺基水杨酸检测2ml 洗脱,流出液量约1ml 时开头 检测蛋白质；（磺基水杨酸检测蛋蛋白质）12d 白质）12d 4,收集含有蛋白质的峰液10,收集含有蛋白质的峰液5,连续用 NH4AC 11,连续用缓

34、冲离子交换柱层析缓冲液洗涤；（BaCl2 检测至液洗涤约2ml ；（BaCl2 检测至SO42-阴性）SO42-阴性）7,用 NH4AC 缓12,用缓冲液再生平稳；冲液再生平稳；1,除盐后收集的球蛋白过5,除盐后收集的清蛋白过DEAE- 纯化DEAE- 纤维素层析柱（6cm）纤维素层析柱（1.06cm）；6,用1ml 0.06mol/L NH4AC 缓冲2,用缓冲液清洗层析柱内壁, 连续用液清洗层析柱内壁, 用约mL 缓冲液 缓冲液流洗,除3ml 洗脱,流出液量约1ml 开头 检测蛋白质；（磺基水杨酸检测蛋去 球蛋白和 球蛋白；7,用缓冲液约白质）3ml 洗脱,流出液量约2ml 开头检第 11

35、 页,共 18 页3,收集含有蛋白质的洗脱液每测蛋白质（磺基水杨酸检测蛋白管10d,连续收集3 管；质）；4,DEAE- 纤维素柱不用再生,可 直接用于纯化清蛋白8,收集含有清蛋白的洗脱液每管 10d,连续收集2 管 9,DEAE- 纤维素柱先用6ml NaCl NH4AC 溶液流洗,再用 10ml NH4AC 缓冲液流洗再生平稳；离子交换柱再生 取含球蛋白浓度最高的 1 管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）和蛋白纯度鉴定 2 管含清蛋白的溶液均作纯度鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳法）醋酸纤维素薄膜 1,点样粗面点样线尽量点得细窄而匀称；电泳 2,电泳：薄膜粗面对下 点样端置阴极端 两端紧贴在滤纸盐

36、桥上,膜应轻轻拉平；3,染色和漂洗：电泳完毕后,关闭电源,将膜取出,直接浸于染色液中5min；取出膜,尽量沥净染色液,移入漂洗液中浸洗脱色（一4,留意事项：的溶液浓度弄错；般更换2 次）,至背景颜色脱净为止；取出膜,用滤纸吸干即可；电泳是切勿使点样处与电泳槽接触；所用血清应新奇,无沉淀物及细菌滋生；使用时勿将各时段所应用上样时,滴管应沿柱上端内壁加入样品,动作应轻,慢,勿将柱床冲起；流洗平稳时亦应如此；洗脱时应留意准时收集样品,切勿使蛋白质峰溶液流失,并留意层 析柱不要流干,进入空气；第 12 页,共 18 页切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查 者与相应物质生成的沉淀均为白色；SO42-的Ba

37、Cl2 混淆,因二葡聚糖凝胶价钱昂贵,要回收再生 ,防止损耗,严禁倒掉. 当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时,不要使液面低于纤维素膜表面,以免空气进入凝胶床；第 13 页,共 18 页【试验报告其次部分（试验记录）：主要试验条件（如材料的来源,质量；试剂的规 格,用量,浓度；试验时间,操作要点中的技巧,失误等,以便总结试验时进行核对和 作为查找成败缘由的参考依据）；试验中观看到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变 化）；原始试验数据；评分（满分20分）：XX】1,主要试验条件：粗盐提取时：由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小,所带电荷 的多少和亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一

38、样；调剂盐的浓度可使不同的蛋白 质沉淀从而达到分别的目的；血清清蛋白和球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中清蛋白不沉 淀,存在于上清液中；球蛋白沉淀,蒸馏水溶解；脱盐（凝胶层析）：凝胶层析法主要是依据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分别的技术；纯化（离子交换层析）：离子交换层析是指流淌相中的离子和固定 相上的离子进行可逆的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分别；醋酸纤维素薄膜电泳：血浆中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于；它们在 的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动；由于血 浆中各种蛋白质分子大小,外形及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同；因此可以将它们分别为清

39、蛋白（- 球蛋白, - 球蛋白5 条区带；Albumin ,1- 球蛋白, 2- 球蛋白, 操作与失误：在进行球蛋白纯化时,观看不认真,显现沉淀后没 有准时收集蛋白液；导致没有收集到球蛋白；在醋酸纤维素薄膜上点样时,发觉无光面粗面之分,后来发觉是 镊子夹取了两张薄膜；第一次点样时多次点样,有时未点到点样线上的；2,试验中观看到的现象：粗提试验时,加入饱和硫酸铵溶液后,溶液变浑浊,有乳第 14 页,共 18 页白色沉淀生成；得到的含清蛋白的溶液与含球蛋白的溶液均呈淡黄色；脱盐（凝胶层析）时溶液中的色素随着蛋白质一起通过层 析柱；纯化（离子交换层析）时胆色素却吸附在了阴离子交换吸附 柱上；电泳后漂洗染色后显现显色条带；3,原始试验数据：见试验第三部分第 15 页,共 18 页【试验报告第三部分（结果与争论）：结果（定量试验包括运算）：应把所得的试验结 果（如观看现象）和数据进行整理,归纳,分析,对比,尽量用图表的形式概括试验的 结果；争论：不应是试验结果的重述,而是以结果为基础的规律推论；结论：简洁扼要,说明本次试验所获得的结果；1,结果:（包括摸索题）；评分（满分45分）：XX】 球蛋白清蛋白