PCR技术原理及其应用

1、PCR 技术原理及其应用【摘要】 聚合酶链反应（PCR）技术，是八十年代中期发展起来的新技术，它 的诞生改变了分子生物学研究的指导方法。由高温变性、低温退火（复性）及适 温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的 DNA 得以迅速扩增，具有 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。因此， PCR 技术在建立的短短 几十年中，便迅速进入生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、人类 学等领域，并取得丰硕成果。【关键词】 PCR 原理， PCR 技术的应用一、PCR技术原理PCR技术是一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法。其基本点是重复利 用扩增引物，以扩增的目标序列为模板，在DNA聚

2、合酶作用下进行体外目标序 列的合成。一个循环周期包括三个步骤，即模板DNA变性，一定温度一定时间 使靶序列双链解离成单链；引物与靶序列退火，一定温度一定时间使两个引物分 别结合到靶序列DNA两条链的3末端；引物延伸，引物沿靶DNA3末端向5 末端延伸。这样三步形成一个循环，并且，前一循环的产物作为后一循环的模板， 使靶序列呈指数倍数进行扩增。1、PCR技术操作的反应体系（1）扩增缓冲液标准的缓冲液含10mM TrisHCl ，pH为8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 C）下，pH值接近7.2。缓冲液中含有一 种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有时

3、使用 Mn2+ 。一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓 度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模 板的扩增效（2）脱氧核苷三磷酸（ dNTP ）脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP 、dTTP、 dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM （即饱和浓度）。 dNTP 的浓度会影 响扩增的产量、特异性和忠实性。（ 3）引物在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即lp

4、mol/ml , 在100卩l反应体系中相当于6x1013个分子。如果5%用 于扩增1kb的DNA片段，可得到3.3 p g的产物，足以用于常规分析。（4） 模板模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩 增，104 至107 个模板分子可达到满意的效果。 用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行扩增时，一般使用1 p g DNA ,相当于单拷贝基因有3 X 105个拷贝。 以酵母菌、细菌、质粒的 DNA 作模板时，要达到这么多拷贝数分别需要 10ng ， 1ng ， 1pg 。（5）DNA 聚合酶 TaqDNA 聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌，为 单分子酶，在75 C活性最强。具有

5、5-3合成活性和5-3外切活性， 但是无3-5外切活性。在95 C的半衰期为40分钟。启动PCR反应 的能力很强，聚合速度快，在 72C 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。由 于没有 3-5 外切活性，在扩增过程中有 8.9-11x10 -5 的错配几率。2、PCR 技术操作的温度监控在典型的反应中，9095C使双链DNA变性，在4060C下让引物与模板DNA退火，在7075 C下用Taq聚合酶催化新链延伸。反应时间应与 放大的片段长度而定，开始时模板变性时间要适当延长，最后一次循环延 伸时间要保持5分钟，反应终止要立即放到4C中或加入10mM EDTA以终止 反应。3、反应体系各组分的特

6、异性影响(1)模板DNA模板可以是dsDNA、ssDNA、mDNA (逆转录为cDNA )。操作中对模板要求不高，纯度要求低，用量少，甚至可以用单个细胞的水 煮裂解物。实验表明，目标片段起始量过高反而使扩增效率下降。( 2)引物引物为人工合成。 PCR 技术操作要求目标片段两侧序列可知。扩增片段长度由引物决定，引物特异性决定扩增片段的特异性。一 般对引物要求：1530bp引物(特别是3端)应尽量避免发夹结构 两引物避免有互补与核算序列库其他序列无明显同源性两引物的 C+G% 含量尽可能相似。引物设计不当则特异性差，非特异扩增产物增加，甚至 不扩增出所需目标片段。Taq聚合酶 通常的聚合酶在95

7、C已完全变性，Taq聚合酶具 热稳定性，该酶具有5 3聚合活性和5 3外切酶活性，即不能校 对错误掺入碱基。Taq 聚合酶在 95C1 小时仍有 40%的活力，这一特点完全适合 PCR 反应， 其最适温度为7580 C。其催化效率达150NT/秒/酶分子。使反应在高温 下得以完成，大大降低 DNA 二级结构的影响，可扩增较长片段，也使模板 与引物杂交专一性提高。4)Mg2+ 为 Taq 聚合酶所必需 ,但过高会影响酶活性 ,也影响退火等。K+可促进退火，过高也抑制酶活性。四种dNTP浓度过高将使参入错误增高。二、 PCR 技术的应用1、研究方面PCR 技术在研究方面的应用， 主要是体外扩增 D

8、NA 的直接序列测定； 使 用可直接进行化学修饰的 PCR 引物在 PCR 产物中导入所希望的变化；应用 PCR、GC夹子和变性梯度凝胶电泳测突变；稀少转录产物的快速克隆和序 列测定；反向 PCR 扩增原来位于核心顺序两侧的 DNA 序列，从而产生未知 序列的探针或确定上游和下游两侧区域的序列；通过 PCR 技术的进化分析， 如 mtDNA 的 PCR 扩增及直接测定序列获得了对证实“人类 mtDNA 进化树的 根源在非洲”这一想法有价值的资料。 Thomas 从保存标本的皮肤扩增 m +DNA，在DNA序列上进行了鼠类的群体研究。PCR的应用使研究对象的非创 造性采样成为可能，对濒危物种的研

9、究也有较大价值。2、临床医学方面遗传疾病多为基因的重排、 缺失和突变。 PCR 技术作为基因分析手段已 被应用于疾病的诊断，如镰刀状贫血病、地中海贫血症及Bart s 等的基因分析以及产前基因诊断、基因转位活化癌基因的分析、感染性治病原的 检测和致病基因的检测，例如已成功地用于与 AIDS 相关的 HIV-I 的检测， 并已研制成对乙肝 HBV 和与宫颈癌有关的 HPV 病毒的分析检测试剂盒。3、分子考古、法医学、和人类学方面DNA 来源量少，如头发、血迹、单个二倍体细胞、单个精子等，可用 PCR 技术从中提取微量 DNA 做模板进行扩增，产生目标片段供分析研究。如 从 4 万年前西伯利亚长毛

10、象冰冻的象毛中提取 DNA 经 PCR 扩增经行分子考 古。又如人的 DNA 中很多特定序列具有高度多态性（如 HLA D 区），这些 序列对每个人都是特定的，这就是 DNA 指纹，通过 PCR 技术可用于血缘关 系、法医学以及人类学上的基因分析。PCR 技术的广泛应用，充分显示出其独特的优越性，但是， PCR 技术本 身还有待进一步完善。在扩增时，仍然存在一定频率的错配，导致扩增产 物发生突变。因此，如何提高扩增产物的质量、提高反应的特异性、消除 扩增平台期以及怎样快速、简便制备 PCR 样本都有待进一步解决。总之，PCR技术正以强大的生命力向各个领域渗透，已经取得了很大的成就。但是就技术本身而言，需要进一步发展和完善，在实践中进一步拓 展其应用领域。总结在遗传学实验课上，通过 PCR 方法测定人类性别的实验，对 PCR 技术有了 初步的了解，但对其原理和应用范围仍存在许多不了解和疑问。于是经过查文献 和资料，进一步了