液相串联质谱法在生物样品分析中的几个关键问题

1、LC/MS/MS在生物样品分析时的关键问题2022年10月2日 简介 LC/ESI-MS/MS是近10年来发展成熟的分析技术，它集高效液相色谱的高分离性能与质谱的高灵敏度、高选择性的优点于一体，已成为定量测定生物样品中药物及其代谢产物的最强有力分析手段。 然而，它在分析生物样品过程中也碰到了具有挑战性的问题基质效应，对于以人参皂苷为代表的中性、热不稳定、难于离子化的皂苷类化合物来说，基质效应的影响更为严重。 离子抑制效应不仅影响检测的灵敏度，也影响定量的准确性，因为这种抑制效应在不同个体的相同生物基质间、甚至同一个生物样品在不同的色谱保留时间可能均不一样，这样就会使测试结果的准确性受到严重影响

2、。 吉林大学药物代谢研究中心2022年10月2日基线 1234567891011Time, min20%40%60%80%100%Intensity, cps吉林大学药物代谢研究中心2022年10月2日血浆样品经液液萃取处理得到的谱图 Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%吉林大学药物代谢研究中心2022年10月2日Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%血浆样品经SPE处理得到的谱图 吉林大学药物代谢研究中心2022年10月2日尿样

3、经液液萃取处理得到的谱图 Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%吉林大学药物代谢研究中心2022年10月2日Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%尿样经2次水洗后的液液萃取处理得到的谱图 吉林大学药物代谢研究中心2022年10月2日吉林大学药物代谢研究中心考察基质效应方法柱后补偿技术（Post-column addition/infusion, PCA/PCI）补偿标准品溶液，以空白基质提取物进样测定-位置、强度标准溶液进样；等量的

4、标准溶液加入空白基质提取物中进样；二者峰面积比较液相系统色谱柱质谱三通阀注射泵2022年10月2日基质效应产生原因外源杂质的引入（不同厂家生产的试管、肝素锂）生物样品内源性基质共洗脱作用co-elution生物样品与分析物形成新的化合物柱超载作用(column overload)吉林大学药物代谢研究中心2022年10月2日吉林大学药物代谢研究中心影响检测的灵敏度1影响定量的准确性2基质效应的结果2022年10月2日Key Point 2选择合适的内标提高待测物的离子化效率、降低基质效应Key Point 1关键问题提高LC/MS/MS的工作效率Key Point 3吉林大学药物代谢研究中心20

5、22年10月2日提高离子化效率 1、改进雾化效果 产生更多更小的液滴，提高离子/分子转化比。 2 、模式选择及优化措施 酸性化合物流动相中加盐,如甲酸铵、乙酸铵，或碱（氨水）来增强化合物的离子化，一般采用负离子检测模式。 碱性化合物流动相中加酸以增强化合物的离子化,加甲酸的效果可能要好于醋酸和三氟乙酸。酸根负离子会与样品正离子结合降低离子化效率，且三氟乙酸会明显的抑制质谱信号响应，一般用正离子方式检测。 3、慎重选择添加剂 商品化的LC-MS级醋酸铵、甲酸铵含有表面活性剂，抑制电离。实验中若需要，可以用氨水加酸调节而成。 吉林大学药物代谢研究中心2022年10月2日 4、优化仪器参数（DP、C

6、E、IS等） 5、盐类对离子信号的影响 一般小分子盐的摩尔浓度比较高时，在电喷雾系统中有强烈的竞争性离子化作用，导致较强的离子抑制效应，使得待测物的灵敏度明显降低。 其次，盐类的存在将产生一系列的离子加合峰，使得谱图的解析变复杂。此外，太多的盐类会腐蚀和污染质谱系统硬件，严重时导致硬件损坏，需要及时清洗。 高浓度的盐对电喷雾有明显负作用，微量盐可能有助于某些物质的灵敏度提高。一些不挥发盐，如磷酸盐、氯化钠等，对质谱造成不可逆损伤。高盐类样品，进样前一般要进行脱盐处理。6、控制进样浓度及上样量 色谱柱、质谱超载 吉林大学药物代谢研究中心进样浓度大上样量大2022年10月2日吉林大学药物代谢研究中

7、心Mass Spectrometry Reviews, 2001, 20, 362 3872022年10月2日消除/减小基质的途径吉林大学药物代谢研究中心样品处理液相条件选择质谱条件选择2022年10月2日Protein-precipitationLiquid-liquid partitioning(extraction) Solid Phase extractionOff-line/On-line 2-Dimension LC(column back-flushing)吉林大学药物代谢研究中心样品前处理方法 选择合适的样品前处理方法是消除基质效应影响最有效的的方式，对于不同的样品处理方法，基

8、质对每种组分的影响也不同，要通过实验综合其他参数（提取回收率，提取稳定性，定量限等）来确定样品前处理方法。2022年10月2日柱子的选择 填料的性质、大小、柱长、柱子口径流动相的选择 组成、比例、流速、缓冲盐、信号增强剂、pH值；洗脱方式的选择（等梯度、梯度）；柱后补偿 碱性药物丙酸、异丙醇；酸性药物2-（2-methoxyethoxy)ethanol。吉林大学药物代谢研究中心优化液相色谱条件 适当地增加待测组分的保留时间；减少进样体积2022年10月2日离子源（ESI、APCI）选择：总的趋势 ESI较APCI更易受基质效应的影响。检测方式（负离子、正离子扫描方式）吉林大学药物代谢研究中心优化质谱检测条件2022年10月2日吉林大学药物代谢研究中心双内标法提高LC/MS/MS分析的准确性20