新生儿CYP1A1、GSTM1、GSTT1基因的多态性调查

1、新生儿CYP1A1、GSTM1、GSTT1基因的多态性调查【摘要】目的研究新生儿yp1a1、gst1、gstt1基因的多态性分布，为新生儿建立相应基因型记录，到达防病治病的目的。方法搜集新生儿脐血，抽提其中有核细胞的dna，pr扩增yp1a1、gst1、gstt1基因的特征性外显子片段。限制酶切yp1a1扩增产物，rflp分析每个标本的基因型；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析gst1、gstt1的基因型。结果yp1a1、gst1和gstt1基因型均呈多态性分布，yp1a1的基因型分布有3种，分别为a/a基因型占60.9%、a/g基因型占34.5%、g/g基因型占4.5%；gst1的基因型有2种分别

2、为gst1+/+和gst1+/0占85.5%、gst10/0占14.5%；gstt1基因型分布为gstt1+/+和gstt1+/0占76.4%，gstt10/0占23.6%。结论在正常出生的新生儿中，代谢酶yp1a1、gst1、gstt1基因存在着多态性分布的现象。【关键词】婴儿，新生；细胞色素p450；谷胱甘肽-s-转移酶；基因distributinfplyrphisfinfantyp1a1，gst1andgstt1gentypeszhuyi,xingi,azhiing,etal.tngjiedialllege,huazhnguniversityfsieneandtehnlgy,uhan43

3、0030,hina【keyrds】infant;ythrep450;glutathinestransferases;geneplyrphis人类的许多疾病都与其自身的遗传因素有关，如视网膜母细胞瘤、家族性结肠息肉病等；甚至某些恶性肿瘤的发生也有遗传性的易感倾向18。已有研究证实，肺癌、肝癌、慢性阻塞性肺疾病等多种疾病与代谢酶细胞色素p450ythrep450,yp450和谷胱甘肽s转移酶glutathinestransferase,gst的多态性有关46。新生儿的遗传物质受外界影响最小，基因突变的几率最小，能比较全面地反映其基因型概况。本实验用新生儿脐血中有核细胞的基因组dna，通过pr扩增y

4、p1a1、gstt1、gst1的基因片段，限制性片段长度多态性restritfragentlengthplyrphis,rflp分析yp1a1基因，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析gstt1、gst1的基因片段多态性，为新生儿建立基因档案，进一步指导他们在以后生活中有目的地进展防病治玻1材料与方法1.1仪器与试剂一次性负压自动抽血试管武汉致远医疗器械设备，低温离心机siga公司。pt100型程控热循环仪美国，超声波细胞破碎仪美国，震荡器，恒温摇床，低温冰箱，恒压电泳仪，垂直电泳槽，edta，trisl，平衡酚，异戊醇，三氯甲烷，十二烷基磺酸钠sds，无水乙醇；pr扩增缓冲液内含15l/lgl2，t

5、aq热聚合酶，四种寡核苷酸混合物每种浓度均为1l/l，扩增基因片段的引物，限制性内切酶nl及其酶切缓冲液。dna片段大小的标准参照物dnaarkerpbr3220dna/hae、pbr322dna/sp华美生物工程公司。pr扩增缓冲液，电泳缓冲液tbe，硼酸，蔗糖二甲苯青ff，溴芬蓝，硝酸银，氢氧化钠，甲醛，硝酸，不同浓度的pbs缓冲液，过硫酸铵等。新生儿脐血110份。1.2方法25241抽提。冰冷乙醇沉淀。te缓冲液保存。部分序列271bp与gstt1基因部分序列480bp的扩增：gst1基因引物为上游：5tgtattgattgatggg3；下游：5tggattgtagagatatg3。gs

6、tt1引物为5ttttatggttaatt3，5agtgatttggaagtgt3。同时共扩增人体珠蛋白基因glbulin片段作为内参对照，引物为glbulin:5aattatagtta3，5gaagagaaggaaggta3，扩增片段大小为268bp。gst1外显子4部分序列271bp与gstt1基因部分序列480bp的扩增：gst1扩增pr反响条件：反响体积为50l,含10pr缓冲液5l(50l/lkl,10l/ltrishl,15l/lgl2，dntp200l/l，引物浓度0.3l/l，50ngdna，2u的taqdna聚合酶。pr反响程序为94初始变性5in后进展30次循环：951in

7、，551in，721in，之后72延伸5in。gstt1扩增pr反响条件：pr反响体积为100l，含10pr缓冲液10l(50l/lkl,10l/ltrishl,15l/lgl2，dntp200l/l,每条引物30pl,50ngdna,2u的taqdna聚合酶。pr反响程序为94初始变性5in后进展29次循环：9530s，5530s，721.5in，之后72延伸5in。反响体系的组成：灭菌的重蒸水12.3l,re10缓冲液2.0l，乙酰化的bsa0.2l(10g/l，pr产物0.2g/l5l，管内均匀混合，然后参加限制酶0.5l(10u/l，终体积20.0l，震荡器上震荡5s混匀，然后离心几分

8、钟，37孵育5h后，4冰箱储存。2结果yp1a1的a/a、a/g和g/g基因型频率分别为60.9%67/110、34.5%38/110和4.5%5/110；gst1的基因型有2种，分别为gst1+/+和gst1+/0占85.5%94/110、gst10/0占14.5%16/110。gstt1基因型分布为gstt1+/+和gstt1+/0占76.4%84/110，gstt10/0为23.6%26/110。见表1。表1新生儿代谢酶yp1a1、gst1、gstt1的基因型分布3讨论细胞色素p450(ythrep450,yp450)酶是由其相应基因编码的超家族酶系，广泛存在于人体的各种组织中，为外源性

9、化合物在体内代谢的相酶，主要参与把疏电子的、非活性基团的化合物转变成亲电子的、带有活性基团的化合物的过程。yp多数成员的某些等位基因存在多态性的变异体，这些变异体基因所编码酶的代谢活性相差数十至数百倍，这种遗传性的差异在人群的自然发病方面有重要意义。人类的yp1a1是一个yp的亚家族；它位于第15对染色体的短臂上，有7个外显子，主要编码多环芳烃诱导的芳香烃羟化酶。该酶高度保守，主要参与烟草中前致癌物的代谢，如激活存在于多种上皮组织中的pahs和芳香胺。yp1a1的诱导作用可以被芳香族诱导复合体与芳香烃受体的特异性结合所引发，芳香烃转位体基因进一步参与yp1a1的诱导通路。但迄今尚没发现芳香烃受

10、体多态性和肺癌风险之间的关系。yp1a1多态性位点有两个，一是sp酶切位点的突变1)，增加酶的催化活性；二是yp1a1基因第7外显子a、g碱基的互换使与血红蛋白结合区异亮氨酸变为缬氨酸2，改变了蛋白质的折叠，增加乙氧基-0-脱乙烷酶的活性，也有可能与其他功能性的多态性连锁在一起起作用。吸烟人群中，异亮氨酸-缬氨酸突变型携带者白细胞中的pahdna加合物比非携带者多7；在具有sp酶切位点多态性的新生儿脐血和胎盘组织中也发现这些加合物的升高8。致癌物代谢的相酶和相酶之间互相作用。在人类的细胞中yp1a1基因型与gst10/0之间互相作用增加dna损伤和患肿瘤的风险，gst1基因缺失与2，4，7，8

11、-四氯二苯对二氧化物强诱导的yp1a1的转录有关。检测吸烟者肺组织加合物时发现gst1缺乏的表现型与yp1a1的高诱导性或yp1a1的等位基因的变异体之间的互相作用，可以导致具有yp1a1/sp/spgst10/0基因型的高加索人加合物程度很高。也有报道yp1a12rl/gst10/0基因型在肺鳞状细胞癌的发生中有重要意义9。我国学者对江苏人群yp1a1和gst1基因多态性的个体肺癌易感性的研究中发现，yp1a1异亮氨酸/缬氨酸或yp1a1缬氨酸/缬氨酸基因型与gst1基因缺失型的个体患肺癌的风险增加10。gsts家族是人体内参与生物代谢的二相酶系，把活泼带电子的有致癌才能的化合物转化为灭活、

12、无致癌活性的无毒物质后经其他途径排出体外，在人体的生物代谢中起着重要的作用。gst1与gstt1基因属于gsts基因家族成员，分别定位于染色体1p13.3、22q11.2区11，gst1与gstt1纯合性缺失基因型可导致其产物gst1和gstt1酶蛋白的表达缺失从而使其对外界的某些致癌物如多环芳烃化合物解毒作用缺陷。研究说明，gst1与gstt1基因的纯合性缺失与某些肿瘤，如肺癌、乳腺癌等的发生相关12，13。人的基因型是重要的遗传标志，在其一生中参与生命活动的生物大分子都是有明确基因编码的，不同基因型个体体内的功能性蛋白质分子差异很大，可表现为对某些疾病的易感性不同，因此一样生活环境下的人群

13、中，某些疾病的发生存在着明显的个体差异。本实验通过检查新生儿代谢酶yp1a1、gst1、gstt1基因型，建立人个体的基因型档案，对指导不同基因型人个体的一生中的防病和治病有重要的意义。【参考文献】2jhnstner,ruefliaa,les.apptsis:alinkbeteenanergenetisandhetherapy.ell,2002,108(2):153-164.3hayashisi,atanabej,nakahik,etal.genetilinkageflunganerassiatedspplyrphisithainaidreplaeentintheheebindingreginfthehuanythrp4501a1gene.jbihe,1991,110:407-411.5jurenkvairnvan,vha,buhardy,etal.glutathinestransferasegst1,gst3,janer,1999,81(1):44-48.9learhandl,sivaraanl,pierel,etal.assiatin