倒置相差显微镜及荧光显微镜原理、使用与注意事项

1、倒置相差显微镜及荧光显微镜的使用XXX,YYY,ZZZ（版权所有,仅限个人1倒置相差显微镜倒置相差显微镜,是将相差显微镜和倒置显微镜相结合的产物,倒置相差显微镜 既具有倒置显微镜的倒置观察方式,同时又具有与相差显微镜相一致的成像原理。因此,研究倒置相差显微镜的工作原理就需分别研究倒置显微镜和相差显微镜 的工作原理。1.1倒置显微镜的工作原理:倒置显微镜组成和普通显微镜一样,主要包括三部分:机械部分、照明部分、光 学部分。其中与普通显微镜有明显区别的是:物镜与照明聚光系统的相对位置。相 比于普通显微镜,倒置显微镜的物镜与照明聚光系统以载物台为轴颠倒位置,物镜在 载物台之下,照明系统在在载物台之上

2、。这样的构造使得照明聚光系统与载物台的 有效距离可以显著扩大,便于放置培养皿、细胞培养瓶等较厚的待观察器具,而同时 物镜与材料之间的工作距离不必很大。图1.1倒置显微镜由于倒置显微镜观察的材料一般都是培养的细胞，透明性大，结构对比不明显，故 倒置显微镜常配备相差物镜，实际上也就构成了倒置相差显微镜（图1.1。1.2相差显微镜的工作原理：1.2.1光学知识镜检时，视场中的样品只有在其透射光的波长（颜色和振幅（亮度与周围介质有明 显变化时，才能被眼睛所分辨。照明光线通过无色透明的物体时，透射光的波长和振 幅都不发生明显改变，尤其是振幅，几乎无变化。所以用普通光学显微镜观察时，难以 辨清这样物体的结

3、构，必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的透射光在 波长或振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，以供识别束光线在透过折射率n不同的透明介质后，产生的衍射光和透过的直射光的波长没有明显变化,只是衍射光的振幅稍小于直射光,这也是透明不均质物质产生些 许明暗变化的原因，但这点变化很小，并不能有效分辨。变化明显的是衍射光相对 透射光在相位上有1/4的滞后，虽然人眼不能分辨相位的差别,但可以分辨振幅和波 长的变化。相差显微镜就是利用这点，将相位的差别转变成振幅的变化，也就是将 本来均为透明但折射率不同的各个结构显现出明暗差距，从而可以被清楚地分辨。可见光光线通过介质水或其他小分子匀质物质时，

4、由于介质分子远小于可见光 波长，故而光的衍射现象并不明显，可以说透射光是直射光。但当可将光透过细胞结 构或其他粒径与入射光波长相近的物质结构时，就会产生明显的衍射现象，透射光转 化为衍射光。也就是说，细胞等常见观察物的结构大小刚好可以使可将光产生衍射 现象。相差显微镜就是利用这点。光波通过小颗粒的物体后产生直射光和衍射光， 衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这种直射光和衍射光相遇或光的叠 加，振幅发生变化，光线或明或暗，就是光的干涉现象。1.2.2相差显微镜结构相差显微镜不同于普通光学显微镜，在装置上有四种必不可缺的部件:相差物镜 （内有相板、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜

5、和绿色的滤色镜。122.1 相差物镜（phase contrast objective相差物镜与普通物镜的主要区别在于具有相板结构（图1.2，相板（phase plate是 由光学玻璃制成的，利用光的衍射和干涉现象，将直射光和衍射光的相位差转变为振 幅差。RearFocalP由mPhase RingRearFocalP由mPhase RingPhase C artrast O bjecti vei ApertufeLens- EmemObjctiv&-BareF :Figure 1图1.2相差物镜（示相板在圆形相板的平面上，有一圈与周围（里外相板厚度不同的或凸凹的圆环（图1.3。相板分两部分：

6、（1共轭面（conjugate area :通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可 能是凹陷的。（2补偿面（complemetary area:共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共轭面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质，通常为氟化 镁。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。图1.3相板的种类及构造左上:吸收直射光的明反差相板平面和剖面图;左下:吸收直射光的暗反差相板剖 面图;右上:吸收衍射光的明反差相板平面和剖面图;右下:吸收衍射光的暗反差相板 剖面图;黑色:吸收光线层;浅色:推迟相位层;白色:玻璃。相板的种类比较多，对光的吸收

7、率高低不同，所以产生不同的反差效果，从反差上 大致可分下列两类（图1.4:（1明反差（bright contrast或负反差（negative contrast:是指在相差显微镜的视场中, 物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于周围介质时，直射光被相 板的共轭面（因为在共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质推迟1/4波长,同时吸 收80%90%,振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射没有变 化，由于直射光推迟1/4波长，两者（直射光与衍射光有完全相同的相位,合成波P等于 直射光S与衍射光D之合，即P=S+D,故振幅加大。所以被检物体比只有直射光照射 的背景亮得多。（

8、2暗反差（dark contrast或正反差（positive contrast:是指在相差显微镜的视场中， 背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反,把通过补偿面（因为在相板的补偿面 上涂有改变光波相位的物质的衍射光推迟1/4波长，使衍射光与直射光的相位相差 1/2波长，同时，直射光在共轭面（上涂吸光物质被部分吸收（可能是为了避免背景过亮 影响观察。由于两者在像点相互干涉的结果，使合成波（P=S-D振幅变小，被检物像的 影像比背景显著变暗。图1.4明反差与暗反差左:明反差,直射光（S与衍射光（D相位相同,两波干涉结果合成波P=S+D,振幅加 大;右:暗反差，直射光与衍射光相位相差1/2波长,

9、两波干涉结果合成波P=S-D，振幅 变小。由上所述,正是由于相板的存在,相差显微镜才具有其特殊的分辨能力。在相差 物镜内的后焦面上装有种类不同的相板,因而物镜在明暗反差上可区分为两大类,即 明反差（B或负反差（N物镜和暗反差（D或正反差（P物镜。物镜的反差类别,用英文 字母B或N或D或P标志在物镜外壳上，并兼有高H（High、中M（Medium和低 L（Low等三种不同的反差。有的相差物镜用ph字样的标示。同一反差类别的物镜，依放大率的不同，又可分为10 x、20 x、x40、和100 x数种, 因此,相关物镜种类颇多,一套可多达 20余种。相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜（PL。1.2

10、.2.2 转盘聚光器（turret condenser位于镜台之下，普通聚光器的所在位置上，由聚光镜和环状光阑（annular diapheragm构成。环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置,由大小不同的 环状通光孔构成,不同规格的通光孔环状光阑装配在一个可旋转的转盘上,按需 要调转使用（图 1.5。环状光阑的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内 的相板相匹配，不可滥用。转盘前端朝向使用者一面有标示窗（孔，转盘上的不同部位 标有0、 1、 2、 3和4或0、 10、 20、 40和100字样，通过标示窗显现。 “0”表示非相 差的明视场的普通光阑。 1或10、 2或20、 3或

11、40和4或100，表示与相应放大率 的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。通过手动转入的标示窗内之数字， 表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。标示孔明示场光IW图1.5转盘聚光器的构造122.3 合轴调中望远镜（centering telescope合轴调中望远镜简称CT,又名合轴调中目镜。它是眼透镜，可行升降调节，具有 较长的焦距的一种望远目镜。镜筒较长，其直径与观察目镜相同。它的功用仅作为 环状光阑的环孔（亮环与相差物镜相板的共轭面环孔（暗环的调中合轴与调焦之用。 相差显微镜使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差目镜必须匹配，且环状光阑的孔环 与相差物镜相板共轭面的环孔在光路中要准确合

12、轴，并完全吻合或重叠。以保证直 射光和衍射光各行其路,使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。但是，镜体的光 路中前述两环的影像较小，一般目镜难以辨清，不能进行调焦与合轴的操作，所以必须 借助合轴调中望远镜。1.2.2.4 绿色滤色镜（green filter相差物镜的种类,从色差消除情况来分，多属消色差物镜（achromatic objective或 PL物镜。消色差物镜的最佳清清晰范围的光谱区为510630nm。欲提高相差显微 镜的性能最好以波长范围小的单色光照明，即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进 行照明。所以，使用相差物镜时，在光路上加用透射光线波长为500600nm左右的绿 色滤色镜,

13、使照明光线中的红光和蓝光被吸收，只透过绿光，可提高物镜的分辨能力。 该滤色镜兼有吸热的作用，以利活体观察。1.2.2.5相差显微镜的光路与成像相并显微镜的照明光束，由转盘聚集器环状光阑的环状孔射入聚光镜，透射载物 台上的被检样品，经样品后，入射光除透射的直线光外，同时产生衍射光。衍射光的振幅较小，相 位滞后。直射光和衍射光进入物镜，前者由环状的共轭面、后者由较大的补偿面透 过相板，前后相互干涉造像。样品的影像由直射光（S和衍射光（D经干涉后的合成波 （P造成，即P=SD;背景仅由直射光形成。由于直射光和衍射光两种光波的相位差异 不同造成不同的反差效果，或明反差或暗反差不等视所用物镜的相板类别而

14、定。成 像光束由物镜射入目镜，在目镜的视场光阑处再次放大，并由出射光瞳射出目镜。（图 1.6光源图1.6相差显微镜光路图根据上述原理和结构所制成的显微镜便是相差显微镜。1.2.3相差显微镜的使用1.2.3.1相差物镜的调换安装从物镜转换器上拆下普通物镜，旋入相差物镜,与普通目镜配套使用123.2转盘聚光器的调换安装旋转聚光器升降螺旋,把普通明视场聚光器至最低位,旋松固紧螺丝,卸下聚光 器。把转盘聚光器安放到相应位置上,旋紧固紧螺丝,转动聚光器升降螺旋,使聚光器 升至最高位置。转盘聚光器的标示孔,朝向操作者。此时,转盘聚光器上面的聚光镜 部分,进入光路;下面的环状光阑转盘,可视需要转动使用,把与

15、物镜匹配的环孔旋入 光路,使之处于转盘聚光镜下。转盘聚光器调换安装后,要进行合轴调中,使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合 一。其步聚如下:(1 把转盘聚光器的环状光阑调至“0位”,明视场照明的普通可变光阑进入光路。(2旋转聚光器升降螺旋,聚光器升至最高位。(3 接通照明光源,使视场明亮。(4把被检样品放到载物台上,用低倍(4x物镜聚焦。(5缩小镜座上的视场光阑开孔,至最小。(6 从目镜观察,在暗视场中可见一缩小的、明亮的、多角形的视场光阑图像。(7 转动转盘聚光器的两个调中杆,推动聚光器,把视场中的明亮的多角形的视场 光阑图像,调至视场中央。(8开放视场光阑至视场同大,视两者周边是否完全重合;否

16、则,复用调中螺杆,使 聚光器精神调中。1.2.3.3 把绿色滤色镜放入镜座的滤色镜架上。1.2.3.4相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中相差物镜的后焦面装有相板。按物镜放大率与反差效果的不同,相板圆环(共轭 面的大小与结构亦不同。转盘聚光器的环状光阑为一系列的透光的,不同大小的明 亮环孔,与不同放大率的物镜相应。使用时严格匹配,当物镜更换时,环状光阑亦作相 应的更换或调整。在视场中观察所见,环状光阑为一明亮的圆环,而相板的圆环为一暗环。互相匹 配的明环与暗环大小一致。在使用时两者要合轴,互相重叠。两环的重叠,须通过合 轴调节方能取得。其方法如下:(1 相差物镜与环状光阑的匹配:正确地匹配取决于所

17、用物镜放大率。例如,当使用40 x相差物镜时,环状光阑转向ph3或40位，使相应地环状光阑进入光路。(2把CT放入目镜筒:从目镜筒取出一个目镜,换入调中合轴望远镜(CT。CT为 一眼透镜,也是可行升降调节的望远目镜,专为观察视场中明环与暗环图像之用。因 为用一般目镜看不见两环的清晰图像。CT在使用前眼透镜应处于最低位，即CT为 最短小的状态。(3明环与暗环的聚焦:一手固定位于目镜筒中的CT镜筒,使其透镜位置不能上 移，另一手逆时针转到CT上部可调的眼透镜部分。转动的同时，通过CT向现场中观 察，刚旋转时，两环可能为模糊的图像，继续转动CT目镜可调部分至清晰地窥见明环 与暗环止。 (图 1.7图

18、5-12光环与相板的合轴过程乩未调正狀态* b.近调正狀态;c. (E常态图1.7光环与相板的合轴过程(4明环与暗环的调中重叠:相板的暗环是固定不动的，处于光路之中,暗环的中心, 即显微镜光轴的中心。环状光阑的亮环可调节移动。转盘聚光器环状光阑的位置， 因聚光器的可调其中心位置，往往偏离光轴轴心，需调整，使其归中。环状光阑的调中 装置或部件,因厂家或型号的不同而有别。如OLYMPUS BH2-PC型相差显微镜，环 状光阑调中装置为位于转盘聚光器两侧的两个伸缩自如的调中螺杆,用以操纵改变 环状光阑的方位，达到调中;而Nikon FIVORPHOT型显微镜的相差装置，其环状光阑 的调中部件为位于转

19、盘聚光器表面，可向任一方向滑动的环状钮。调中时，手指调中 装置，移动明环，使之与暗环合一。在两环调中过程，始终在通过CT的观察下进行。在调节过程中，如亮环比暗环小，并位于暗环内侧时，应降低聚光器位置，使亮环放 大。若亮环大于暗环时，应提升聚光器，使亮环缩小。如聚光器已升至最顶点还不能 完全重合，可能是载玻片过厚之故(5回装观察目镜:待相差物镜的暗环与环状光阑的亮环调中、重叠后,从目镜筒 中取出CT,放回观察用的接目镜，以便镜检观察。1.2.3.5 相差物镜的选择 相差物镜有不同倍率、不同反差类别和反差程度之分。相差物镜的反差类别和 反差程度以及放大倍数,皆用英文字母和数字标示在物镜壳中(表1.

20、1。20XPH20倍正反差反差程度高20XPM40倍正反差反差程度中等lOOxPLIOO倍正反差反差程度低40XNH40倍负反差反差程度高40XNM40倍负反差反差程度中等100XNL100倍负反差反差程度低100XDH100倍暗反差反差程度高40XDM40倍暗反差反差程度中等20XDL20倍暗反差反差程度低10XBH10倍明反差反差程度高20XBM20倍明反差反差程度中等40XBL40倍明反差反差程度低表 1.1 物镜标示解读相差镜检时,依被检样品的种类、结构和反差程度的不同,而确定应选用相差物 镜的种类。这不存在死硬的规定,可依观察者的习惯和爱好而变。通常是哪一种相 差物镜都能得到清晰的像

21、，只是有的物镜更好些而已，因此可任意选择。暗反差物镜 对习惯于明视场镜检者适宜。当与染色标本进行比较或进行测定以及加强半透明物 体的反差时,多用暗反差;而计算数量或观察物体运动以及研究极小的样品时,多使用 明反差。一般来说，相差物镜的应用范围如表1.2。字母反差应用D/P暗/正观察细胞或细胞核的内部结构B/N明/负观察微小的物体如孢子、鞭毛和活的样品等H高当样品反差较低时L低当样品反差较高时M中当样品反差为中等时表1.2物镜应用范围（引自相关作者总之,在相差镜检时，于诸多的相差物镜中选一物镜，绝非易事。除参考上表所列 应用范围外，最佳方法是通过各种类型的相差物镜进行实际镜检测定,找出最宜相差

22、物镜。1.3倒置相差显微镜图 1.8 倒置相差显微镜如图 1.8即为倒置相差显微镜,可以看到整体的倒置构造,以及聚光器、环形光 阑、相差物镜等结构。前面已经介绍了倒置显微镜和相差显微镜的原理以及使用方法。倒置相差显微 镜就是二者的组合体,其原理与使用方法也就是二者的原理与使用方法,一一对应,不 再赘述。2荧光显微镜2.1 荧光概念荧光是物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态,再回到低能状 态时释放出的光,是非温度辐射光,又称冷光。依据产生原因,荧光可分为:化学荧光 （氧化还原反应发出的荧光、光化荧光（光源激发而产生的荧光、生物荧光、放射荧 光四种。荧光显微镜应用的是光化荧光，通常利用

23、紫外光（320-400nm激发荧光物质， 产生可见光荧光,多余的能量以热能放出。可以认为是被检物体自己发出可见光,从 而被观察到。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。对 被检物体来说，荧光产生方式有两种:自发荧光，经过紫外光照射直接发出荧光;继发 荧光，被观察物体经过荧光染料处理之后，经过紫外光照射才能发出荧光。细胞中有 些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后产生自发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光， 但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发出继发荧光，荧光染料种 类很多（表 1.3名称浓度（处理时间（min吖啶橙 0.11.00.53荧光红 0.11.

24、00.53伊红 Y0.112金色胺 0.11.00.53酸性品红 0.112玫瑰红 B0.1110瑰红 G0.10.00113甲基绿 0.10.0113刚果红 0.112中性红 0.10.0055数小时硫酸黄连素 0.10.0021数小时表 1.3 常用荧光染料使用浓度及处理时间一览表注:被检物经荧光染料处理后,荧光的颜色基本与染料的颜色相似,但在不同波长 紫外线的激发下,其颜色也有差异。2.2荧光显微镜结构与原理荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源,经过滤色系统发出一定波长的光（如 紫外光365nm或紫蓝光420nm作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不 同颜色的荧光后,再通过物镜和目

25、镜的放大进行观察（图 2.1。这样在强烈的对衬背 景下,即使荧光很微弱也易辨认,敏感性高,主要用于细胞结构和功能以及化学成分等 的研究。图2.1荧光显微镜2.2.1荧光显微镜分类荧光显微镜按照明方式可分为落射式和透射式两类。落射式荧光显微镜是近代 发展起来的新式荧光显微镜，其激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作 为照明聚光器和收集荧光的物镜。透射式荧光显微镜较为原始，其激发光源是通过 聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。2.2.2落射式荧光显微镜落射式荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。 更适用于不透明及半透明标本,如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观

26、察。落射式荧光显微镜的构造主要包括:汞灯光源、激发滤板、双色束分离器（分色 镜和压制滤板四部分（图2.2。 -objectII图2.2落射式荧光显微镜光路图222.1汞灯光源汞灯光源发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜 普遍采用。现在多采用100200W的超高压直流汞灯作光源，它是用石英玻璃制作， 中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅 速升高，当水银完全蒸发时，可达5070个标准大气压力，这一过程一般约需 515mi n。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射 光量子的结果。超高压汞灯也散发大量热能。

27、因此，灯室必须有良好的散热条件,工作环境温度 不宜太咼。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作 时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减 少启动次数。灯泡在使用过程中,其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能 重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭,以免水银蒸发不完全而损坏电极,一般需要等 15min。超高压汞灯（100W或200W光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在 灯室上有调节灯泡发光中心的系统,灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜,前面安 装有集光透镜。2.2.2.2激发滤板荧光光源采用超高压汞灯,它可

28、发出各种波长的光,但每种荧光物质都有一个产 生最强荧光的激发光波长,所以需要加用激发滤板（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色 激发滤片,仅使一定波长的激发光透过照射到标本上,而将其他光都吸收掉。根据光源和荧光色素的特点,可选用以下四类激发滤板,以便提供一定波长范围 的激发光。紫外光激发滤板:此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可 见光通过。常用型号为UG-1或UG-5,外加一块BG-38，以除去红色尾波。紫外蓝光激发滤板:此滤板可使300450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2 或 ZB-3,外加 BG-38。紫蓝光激发滤板:它可使350490nm的光通过。常用型号为QB2

29、4（BG12。蓝绿光激发滤板:最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素可用之 （如B-7激发。近年开始采用金属膜干涉滤板,由于针对性强,波长适当,因而激发效果比较玻璃 滤更好。如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板，均远 比玻璃滤板效果好。激发滤板分薄厚两种,一般暗视野选用薄滤板,亮视野荧光显微镜可选用厚一 些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。2.2.2.3 双色束分离器光路中需加上一个双色束分离器（分色镜,它与光铀呈 45 度角,激发光被反射到 物镜中,并聚集在样品上,样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射 的激发光同时进

30、入物镜,反回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被 压制滤板吸收。2.2.2.4 压制滤板 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长 更长的可见荧光。荧光具有专一性， 一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧 光，在物镜后面需加压制滤板。它的作用有二：一是吸收 和阻挡激发光进入目 镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧 光色彩。 2.2.3 透射式荧光显微镜 透射式荧光显微镜常用暗视野集光器，也可用普 通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到 标本上这是比较旧式的荧光显微 镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光 减弱所以对观

31、 察较大的标本材料较好。 透射式荧光显微镜的主要构造包括：汞灯光源、激发滤 板、暗场聚光镜、压制滤板四部分（图 2.3）。 图 2.3透射式荧光显微镜光路图 2.2.3.1 暗视野聚光镜 透射式荧光显微镜与落射式荧光显微镜的主要结构的功能相 似，如激发滤板、暗视野聚光镜、 压制滤板等。其中暗视野聚光器需进行主要介 绍。暗视野聚光镜又称暗场聚光镜，在荧光显微镜中 的应用日益广泛。因为激发 光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用 薄的激发 滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板 （不透 过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度

32、和反衬度， 提高了图像的质量，观察 舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。可以 说，暗视野聚光镜是将激发光汇聚，隔绝可 见光，维持暗场的特殊聚光镜。2.3荧光显微镜使用2.3.1荧光显微镜标本制作要求载玻片：载玻片厚度应 在0.8 1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标 本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载 玻片。 盖玻片：盖玻片厚度在 0.17mm 左右，光洁。为了加强激发光，也可用 干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的 物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使 荧光顺利通过，而反射激发光，

33、这种反射 的激发光还可激发标本。标本：组织切片或其他标本不能太厚，应控制在 10um左右为好，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部 不充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，影响判断。采用 石蜡制片时。必须彻 底脱蜡，因为石蜡本身可发青色荧光。玻片最好用莹石玻璃制成的。 封裱剂： 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较 亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等 量混合液作封裱剂。 镜油：一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须 使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也

34、可 用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。 2.3.2荧光显微镜使用方法 打开灯 源，超高压汞灯要预热15min才能达到最亮点。透射式荧光显微镜需在光源与 暗视野聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装 上相应的压制滤片。 落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片、双色束分离器、压 制滤片的插块。用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光 源中心，使其位于整个照明 光斑的中央。 放置标本片，调焦后即可观察。 使用 中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起 眼的损伤；用油镜观察标本 时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需 待汞灯完 全冷却后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 观察。 例如： 在荧光显 微镜下用蓝紫光滤光片， 观察到经 0.01吖啶橙荧光染料染色的细胞， 细胞核和 细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光（暗绿色和橙红色。 2.3.3 荧光显微镜使用注 意事项 严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。 应