单克隆抗体的制备

1、单克隆抗体的制备.抗原的制备：全病毒作为抗原病毒特定蛋白作为抗原动物免疫融合：(1)骨髓瘤细胞准备脾淋巴细胞准备饲养细胞准备细胞融合杂交瘤细胞的检测及筛选阳性杂交瘤细胞的亚克隆腹水的制备吼吼吼，俺是分界线，吼吼吼单抗特性的鉴定：(1)单抗效价测定单抗特异性鉴定杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定单抗的反应性：(1)间接ELISA试验间接免疫荧光试验微量细胞培养中和试验抗原制备（一）全病毒作为抗原收获病毒直接收获病毒培养上清液（马立克是细胞结合性病毒，不能用此法）培养细胞反复冻融-离心（30000rpm离心1h）-重悬（用什么溶液重悬,TNE可以吗）- 收获病毒2仮复冻融三次使细胞破碎释放出病毒（1）

2、提纯浓缩病毒PEG沉淀法3慢慢搅动并加入NaCl终浓度是）.5mol/L有助于病毒的沉淀，再量加入10%PEG（ 般使用PEG6000）4 C过夜或放置一段时间8000r/mir离心30分钝收集病毒沉定；病毒沉淀中加入适量PBS 4C过夜；1000r/mii离心1小时。沉淀即为农缩的病毒（2）提纯浓缩病毒一一蔗糖密度梯度离心法配制25%, 35%, 45%, 55%, 65%蔗糖溶液4用长针管抽取2ml蔗糖溶液，从离心管的底部注入（浓度由低到高）抽取lml病毒液沿管壁缓慢注入6.38000rpm,2h 离心7用注射针抽取离心后出现的病毒条带&用2mL的PBS溶解测病毒浓度（用紫夕分光光度计测蛋

3、白质浓度AQ80C保存备一病毒的冻存（具体程序是什么）使用灭菌过的1次性塑料冻存管贴上标签，标上菌（毒）号及时间，备甩血清可用过滤灭菌牛奶要先脱脂用离心方法去余上层油脂一般在1O0C间歇煮沸23次 每次1030min,备用。在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期进行纯度佥查后，与保护剂混合均匀分装 微生物咅养物浓度以细胞或孢子不少于1010个/ml为宜（二）病毒特定蛋白作为抗1原核表达载体的构建目的基因引物设计PCR扩增目的片段选取适当带标签的表达载体与目的片段进行连接转化获得阳性质粒。蛋白表达：将阳性质粒转化入表达感受态细胞挑菌J、摇至OD值在0.4-0.之间时 添加IPTG诱导蛋白

4、表达IPTG浓度：O.l-l.Ommol/l诱导温度禾和时间37C h30C h2C 2h1C 7h对诱导的大肠杆菌菌液6000rpn离心 10min用1:1OOPBS重悬细菌超声波破碎细胞检测蛋白质是上清表达还是包涵体表达蛋白质勺纯化若蛋白质是上清表达，根据标签直接进行纯化若蛋白质是包涵体表达 先用尿素分离为上清再纯化菌体破碎一离心一等电点沉淀一亲和层析二动物免疫将浓缩后的病毒抗原稀释成浓度为00ug/m或蛋白浓度（有具体的浓度马）选取5只6周龄左右雌性BALB/c小、鼠第一次免疫：将抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化腹部皮下多点注，剂量）.2-0.4mL/ 只（蛋白腹部皮下注射100ug）第

5、二次免疫：23周，将抗原与等量弗氏不完全佐齐充分乳化皮下多点注射0.2-0.4mL只（蛋 白腹腔主射100ug）第三次免疫：2周，方法和剂量同第二次测血青抗体效介一周，断尾采血ELISA包板测效价选择效价高的小鼠，用不加佐剂的抗原尾静脉注射加强剂疫O.lml/只（蛋白为腹腔注射 100ug）6.3d后取小鼠脾细胞与SP2/（细胞融合（一）骨髓瘤细胞的准备1融合前两周：开始复苏骨髓瘤细胞SP2/0,扩大培养融合时确保SP2/0处于对数生长期（如 何确定骨髓瘤细胞处于对数生长期，有良好的形态（骨髓瘤细胞勺正常形态是什么样的）活细胞计数 高 于95%2融合当天,用DMEM不完全培养基将细胞从瓶壁轻轻

6、吹下收集于SOmL离心管内3.1OOOr/n离心I Omin弃去上青4加入30mLDMEM不完全培养基同法离心洗涤一次5将细胞重悬于IOmLDMEM不完全培养基中混匀制成细胞悬液（二）脾淋巴细胞的准备加强免疫后3d :加强免疫的雌生BALB/c小鼠,摘除眼球采血作为阳性血清对照颈椎脱臼致外鼠浸泡于75%酉精消毒其表10min沥干小鼠，随即放超净台内的军剖板上 腹部朝匕四肢固定钝性分离腹膜 无菌取出脾脏，用无血青含双抗的DMEM于1个皿中，一个用来洗脾并用镊子除去 附着的结缔组织脾脏移入200目微孔滤网上于新鲜含双抗DMEM中,用研磨棒轻轻研磨将脾脏制成单细胞悬液可 用吸耳球吹打吧），并移至I

7、OmL离心管中或将弹置于新鲜含双抗DMEM中，用5ml注射器的针头朿脾 来回吹推出脾细胞，lOOOrpn离心6min弃上清20mlDMEM重悬细胞，清洗一遍，lOOOrpn离心6min 弃上清20mlDMEM重悬细胞，无5）置于37C, 5%Cq细胞培养箱中自然沉降1H5min,吸取上清中的细胞悬液弃去肉眼可见组织或 团块2（三）饲养细胞的准备1将阴性BALB/c小鼠摘除眼求采血分离血青,作为抗体检测时的阴性对照血清。-37C30min,4C 过夜，次日6000rpn离心10min2同时颈脱位致死小鼠于75%酉精中浸泡Omin,腹部向上固定砒菌剪开腹部皮肤子剥离皮 肤,暴露腹膜,酒精棉球擦拭腹

8、膜消毒皿中加入0mlHAT完全培养液 用注射器注射L至腹腔注意不要穿入肠管手固触射器 将针头留置在腹控内右手持酒精棉球轻轻按摩腹部lmin,仅可抽吸2-3次,注入培养液后再吸出培养液将皿中液体混匀，加入6孔板，100ul/FL, 37C，5%Cq细胞培养箱中培养，次日观察无污染方 可使用（四）细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养1取计数后的SP2/（细胞与脾淋巴细胞按1:51:1的比例混合于50mL离心管中，1000r/mii离心10min弃上青，用酒精棉擦离心管口。用手掌轻击离丿心瓦 底使沉淀的细胞打散在离心管架j来回拉动，充分混匀至糊状将离心瓶底放入40-41C水浴中边旋转边加入融 合用的PE

9、GlmL（50%37C预热），在lmin内加完，一滴一滴加，不可吹吸，可轻轻混匀4.37C水浴静置）0s继续旋专同时力叭无血清DMEM15mL在90s内加完，由慢到快,前5s加1mL室温静置lomin后，l000r/mii离心 10min,弃上青将HAT选择培养液力叭至细胞融合物中,悬浮细胞分配至己有饲养细胞的96孔细胞培养板,100ul孔，四周多加液，以防蒸干&置于37C, 5%CO细胞培养箱培养9.5d后用新鲜预热的HAT培养基换出一半培养基10.10d后用预热的HT换出HAT11第三次用20%勺FBS12.观察杂交瘤细胞的生长情况,待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时

10、（大约 在细胞融合后15天），吸取适量细胞上青进行抗体检测四.杂交瘤细胞的检测及筛选细胞融合后 15天即可进行杂交瘤细胞的检测和筛选 间接ELISA方法来筛选阳性克隆1融合 10d换液后待杂交瘤细胞生长至培养孔1/1（或者培养上清变黄时吸取待检孑孔上清100uL加 入上述检测板孔中同时设立阳性融合前免疫小鼠眼球采血制备的阳性血筛选时作为阳性对）阴 性（非免疫小鼠畴采血制备勺血清作为阴,对照）和空白对照（以PBST作为空白对照调零孔，37C孵 育lh,同前洗涤拍干2弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。3每孔加200ul封闭液4C过夜或37C封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可

11、省略。洗涤液洗3次；此时包被板可-20C或4C保存备用。5每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37C孵育1-2小时；洗涤，拍干。6加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37C孵育1-2小时，洗涤，拍干。7加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul, 37C10-30分钟。&以2mol/L H2S04终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。9结果判定：以P （待检孔）/N（阴性孔）三2.1即为阳性。若阴性对照孔无色或接近无 色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。五阳性杂交瘤细胞的亚克隆对筛选出的阳性克隆株通过有限稀释去进行亚克隆一般

12、需要四次1采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化克隆前制备小鼠饲养细胞层3将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml 细胞悬液，即每孔含1个细胞。4.37C、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下 观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。5取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存（1）冻存将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右 /ml，分装安瓶，每瓶1ml，置冰浴上;安瓶上表明细胞名称、冻存日期、批号等。安瓶封口后仍置冰浴上。将安瓶放入一带收口

13、绳的小布袋内，布袋上表明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸 管筒内，置-70 C冰箱。2-4小时后或过夜后从-70C冰箱取出吸管筒，将盛有细胞布袋移入液氮罐；在布袋的线 绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜和手套， 以免因液氮冻伤等。用间接ELISA连续险测杂交瘤细胞养上清液中的抗体效价六腹水的制备选81碉龄体重20g以上的雌性BALB/c鼠,腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml只2.1周后，腹腔i射杂交瘤细胞（2xl0护一5xl0细胞/只）3在动物复咅明显曾大时用16号针头从腹腔采集腹水4.3000r/mii离

14、心 10min取上青液测定效价后一80C冻存备用七单抗特性的鉴定（一）单抗效介测定将培养液上清和腹水倍比稀其中培养液上清采用倍倍比稀释腹水先按：10稀释,再按2倍倍 比稀释采用间接ELISA的方法。（二）单抗特异性鉴定抗原病毒及其他相近病毒，收集病毒液冻融3次,12000r/min,4C离心10min,取上清包被96孔酶标板3分别与单抗进行间接ELISA试验4同时收集相对应的未接毒的细胞经相同处理包被96孔酶标板，平行试验以排除背景反应（三）杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定将杂交瘤细胞进行连续传代，每隔一周测定其间接ELISA效价，一直传至20代以评价其 分泌抗体的稳定性八单抗的反应性（一）可接

15、ELISA试验（二）间接免疫荧光试验1用48孔细胞培养板培养细胞当细胞长满单层时接种适量病毒同时 设未接毒的正常细胞作为阴性对照培养5d至病变长至40%时弃去培养基3用PBS洗涤3次每次5min用一20预冷的甲醇4固定10min用PBS洗涤3次每次imin,在吸水纸上拍干分别滴加1:50稀释的腹水单抗,37C作用1.5h用PBS洗涤3次每次imin,在吸水纸上拍干&加入1:20（稀释的羊抗鼠FITC IgG作用45min用PBS洗涤3次每次imin,在吸水纸上拍干在荧光显微镜下观察出现特异性的亮绿色荧光者为阳性反之判为阴性（三）微量细胞培养中和试验1采用固定病毒稀释血清的方法用病毒感染细胞检测

16、单抗腹水对胞的保护力，将5种腹水分别做:& 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512倍 稀释与等量的I00TCID的病毒混合37C水浴lh,50将每一稀释度的病毒腹水混合物接种到长满单层细6孔板中每一滴度加个孔37C,5%C（2培养 逐日观察病变并记录试验设单抗腹水对!组，病毒对组和维持液对!组，计算1保护50%细胞不出 现病变细胞的腹水稀释度溶液配制不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml, NaHCO 3.7g,双抗溶液10ml, 100XL.G.溶液10ml，用1N HC1调试PH至7.2-7.4,过滤除菌，分装4C保存。HAT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml, HT贮存液1ml, A贮存液1ml。HT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml, HT贮存液1ml。氨基喋呤（A）贮存液（100X, 4X10-5mol/L） 称取 1.76mg 氨基喋吟（Aminop terinMW 440.4）,溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1