总抗氧化活性评估

1、3、提取物总抗氧化活性评估采用铁还原/抗氧化能力（Ferric reducing/antioxidant power , FRAP）分析法。取 适量上述样品提取液（必要时稀释），加入1.8ml TPTZ工作液（由0.3moL/L醋 酸盐缓冲液 25 ml、10 mmoL/L TPTZ 溶液 2.5 ml、20 mmol/L FeCl3 溶液 2.5 ml 组成），混匀后37 。反应10 min, 593 nm测定吸光度，以1.0 mmol/L FeSO4为 标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示 试剂的配方：1）TPTZ工作液现用现配：由25ml 300 mmol/

2、L pH 3.6的醋酸盐缓冲液、2.5ml 10mmol/L TPTZ 溶液、2.5ml 20mmol/L FeCl3 溶液混合而成。A: 300 mmol/L醋酸盐缓冲液（PH3.5）取醋酸铵（分子量77） 25g，加水25ml 溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2 mol/L盐酸溶液或5 mol/L氨溶液准确 调节PH值至3.5 （电位滴定法），用水稀释至100 （还是1000?你计算下）ml， 即得。B: TPTZ 是一种化合物 1,3,5- tri（2-pyridyl）-2,4,6-triazine （C18H12N6, TPTZ）的缩 写2,4,6 -三毗啶基三嗪（这个药品实

3、验室估计没有，明天再找找，我买了，估计2-3天到）2）标准曲线的绘制：分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的FeSO4 标准液，加入3ml FRAP工作液，再加入0.3ml标准系列，混匀，准确反应5min， 于593 nm处测定其吸光度，用超纯水调零，绘制标准曲线。样品的抗氧化活性 （FRAP值）以达到相同吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。3）样品的测定：量取0.1ml的样品溶液，加入3ml FRAP工作液，再加入0.3 ml 待测样品，混匀，准确反应5 min，于593 nm处测定其吸光度，用超纯水调零。4、清除羟基自由基（OH）作用（周2可以测，药品都有）

4、 参照邻二氮菲-Fe2+氧化法稍加改进。取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液2 ml于试管中，依次加入pH7.4 PBS 150 mmol/L 2 ml充分混匀后，加0.75 mmol/L硫酸亚铁2 ml，混匀，加0.01%的 H2O2 1ml，用蒸馏水定容至10 ml （加蒸馏水3 ml），混匀作损伤管，于37C下 温育60 min，于536nm处测其吸光度，其值称 AP。未损伤管中不加1ml H2O2，用1ml蒸馏水代替(其余的同AP),测得的吸光度称AB。测定管待测 液0.5 ml (加蒸馏水2.5 ml)测得吸光度为AS。- OH自由基清除率(d)计 算公式：I AS-APd =x 1

5、00%AB-APpH7.4 PBS 150 mmol/L母液的配制：0.2M Na2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2。，溶于 1000ml 水0.2M NaH2PO4:称取 31.2g NaH2PO4-2H2O,溶于 1000ml 水各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配 0.2M PB (pH=7.4, 100ml)：取 19ml 0.2mol/L 的 NaH2PO4, 81ml 0.2mol/L 的Na2HPO4,即可。然后只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，如：0.1M PB (PH=7.4):取 500ml 0.2M PB，加水稀释至 1

6、000ml 即可。0.2M PB (PH=7.4):取 1000ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.15M PB (PH=7.4):取 750ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.01M PB (PH=7.4)： 取 50ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.02M PB (PH=7.4)： 取 100ml 0.2 M PB，加水稀释至 1000ml 即可。蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）：要液体培养后测菌的蛋白质含量Leaves: 0.2ml+1.8ml提取液+2ml考马斯亮蓝（100mg考马斯亮蓝溶于50 ml90%乙醇，加入 100ml 85%的磷酸，用蒸馏水定容到1L，过滤，贮藏与棕色瓶，常温可保存一个月）Roots: 0.2ml+0.8ml提取液+2ml考马斯亮蓝（100mg考马斯亮蓝溶于50 ml90%乙醇，加入 100ml 85%的磷酸，用蒸馏水定容到1L，过滤，贮藏与棕色瓶，常温可保存一个月）2min 后测定OD595标线用0.15mol Nacl配成2mg/m