山大药剂-基因治疗剂型开发课件

1、基因药物纳米载体的构建：原理，展望和挑战Nanoparticles in gene therapy张娜1. Introduction to gene therapy2. Barriers and strategies to gene delivery3. Nanoparticles in gene therapy4. Challenges and prospectsMain Contents1.Introduction to gene therapy 1.1 基因治疗1.2 纳米基因载体系统1.1 基因治疗 基因治疗：是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷

2、或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。 1.1 基因治疗自从1990年美国FDA正式批准第一个基因治疗临床试验以来，世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮。基因治疗经历了狂热期 (19901995) 和理性期 (1996 现在 ) 。/wiley/years.php 在所有的临床试验方案中，恶性肿瘤占全部基因治疗临床试验方案首位，占总数的64.7%。1.1 基因治疗我国是世界上较早开展基因治疗临床试验的国家，基因治疗基础研究和临床试验基本与世界同步2004 年1 月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界上第一个基因治疗产品重组人p53 抗癌注射液(商品名：今又生)正式推向市场，这是全

3、球基因治疗产业化发展的里程碑。 1.1 基因治疗Ex vivo途径: 是目前较常使用的一种基因治疗方法，即将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞 ，经体外细胞扩增后，再输入人体。1.1 基因治疗基因治疗中最关键的技术就是基因的输送或传递 。现有的基因载体包括两类，即病毒载体和非病毒载体。病毒载体非病毒载体1.1 基因治疗/wiley/vectors.php1.1 基因治疗1.1 基因治疗非病毒载体 (non-viral vector), 可以克服病毒载体的很多缺陷 , 己越来越引起科学家的重视。优点：低毒、低免疫反应、易组装、经济、便于大规模普及应用和可反复应用等。缺点：难以通过细胞膜

4、屏障、靶向性差、基因表达不稳定、不能长期表达、转染效率低等。1.1 基因治疗目前已进入临床研究的非病毒载体主要是DNA 载体和阳离子脂质体。DNA 载体又称质粒 DNA (plasmid DNA) 或裸 DNA (naked DNA), 是最简单的非病毒传递系统。 优点：是对机体无毒无害，操作简便缺点：质粒 DNA分子量大，表面带负电，亲水性过强而不易通过细胞膜，易被核酸酶降解，基因转移率较低，而且不稳定，需大剂量多次给药目前只在肌肉和皮肤中可以进行直接的局部裸DNA注射。脂质体：作为载体进行基因输送的研究已有20多年,并且至今已有多种商品化阳离子脂质体转染试剂问世，这是因为脂质体可促进大分子

5、物质对细胞膜的穿透。但其存在一些缺点：有细胞毒性，易泄露，体内不稳定性。1.1 基因治疗新型非病毒载体的开发成为基因治疗研究的热点随着纳米生物技术的飞速发展，一种新型的非病毒载体系统纳米基因载体系统的出现为基因治疗注入了新的活力。纳米基因载体系统：将基因治疗分子包裹在纳米颗粒中或吸附在其表面，同时也可在颗粒表 面耦联特异性的靶向分子，通过 靶向分子与细胞表面特异性受体 结合，进入细胞内，释放基因发 挥治疗效能，实现安全有效的 靶向性基因治疗。1.2 纳米基因载体系统纳米粒具有超微小体积，能穿过组织间隙并被细胞吸收，可通过人体最细的毛细血管，可通过血脑屏障。1.2 纳米基因载体系统1.2 纳米基

6、因载体系统纳米载体作为基因载体的独特优势：1.纳米颗粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解2.比表面积大，具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性3.在循环系统中的循环时间较普通颗粒明显延长，在一定时间内不会象普通颗粒那样迅速地被吞噬细胞清除4.让核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的产物浓度，提高转染效率和转染产物的生物利用度；5.代谢产物少，副作用小，无免疫反应等2. Barriers and strategies to gene delivery 胞外屏障，指载体进入机体到达靶细胞之前所遇到的障碍 ,包括降解酶系统 、吞噬系统 、调理化作

7、用和胞外粘膜层等 ；胞内屏障，包括靶细胞膜、内吞小泡和细胞核膜等。载体在输送基因的过程中要遇到二个主要的障碍：2.1 胞外屏障细胞外障碍是导致体内和体外转染效率差异的重要因素。调理作用24Non-specific BindingBlood circulation无PEG修饰载体与血浆蛋白发生非特异性结合2.1 胞外屏障25PEG 修饰有效降低载体与血浆蛋白作用2.1 胞外屏障2.2 胞内屏障Cellular bindingCellular uptake Endosomal escapeNuclear entry目的基因被输送至靶细胞后 , 一般是通过内吞方式进入细胞，了解载体的细胞内命运，对载

8、体设计具有重要的指导意义Liu C, et al. CurrGeneTher.2009 ;9(4):267-90.2.2 胞内屏障Cellular binding一旦基因载体到达靶细胞附近，遇到的第一道屏障是细胞膜。跨越细胞膜被认为是限制DNA有效转染的关键步骤之一。非受体介导（Non-receptor mediated binding）受体介导（Receptor mediated binding）2.2 胞内屏障Cellular binding非受体介导（Non-receptor mediated binding）硫酸肝素蛋白多糖（HSPGs）：阳离子载体与细胞表面强负电的细胞膜糖蛋白结合N

9、on-receptor mediated binding小于30个氨基酸的短肽，通常为两亲性，带高密度正电荷典型代表：HIV-TAT优点：可有效穿透细胞膜，可有效促进DNA, 脂质体，纳 米粒等进入细胞缺点：无选择性穿透所有细胞膜; 穿膜机制不明确2.2 胞内屏障Cellular binding细胞穿透肽 Cell-Penetrating Peptides (CPPs)：2.2 胞内屏障Cellular bindingTAT可有效促进脂质体，纳米粒等进入细胞2.2 胞内屏障Cellular binding受体介导（receptor mediated binding）通过连接特定的配基，可以将载

10、体特异性的运送到靶细胞通过配基修饰的纳米粒可以通过受体介导内吞过程快速有效的被靶细胞摄取，大大提高转染效率受体介导内吞过程2.2 胞内屏障Cellular bindingMostly used ligandsReceptorsLigandsCellsTransferring receptorTransferringVariousAsialoglycoproteins receptorAsialoglycoproteinsHepatocytesGalactoseLiver-parenchymal cellLactoseHepatocytesMannose receptormannoseMacro

11、phagesEpidermal growth factor receptor (EGFR)EGFVariousFolate receptor (FR)FolateVariousLow density lipoprotein (LDL) receptorLDLVariousIntegrinsArg-Gly-Asp(RGD) peptidesTumor endotheliaAminopeptidase N (APN)Asn-Gly-Arg(NGR) peptidesTumor endothelia2.2 胞内屏障 Cellular uptake 几种内吞途径:不同的内吞机制:2.2 胞内屏障 Ce

12、llular uptake 笼形蛋白介导内吞途径The best-studied pathway一般来讲，笼形蛋白依赖的细胞内摄过程会经历一个早期内吞体到晚期内吞体，再到溶酶体的过程，这个过程pH逐渐降低，并且溶酶体内含有大量酶，会导致运载的基因药物降解2.2 胞内屏障 Cellular uptake 2.2 胞内屏障 Cellular uptake 小窝蛋白介导途径（Caveolae-mediated pathway）因为可以避过溶酶体降解而备受关注。2.2 胞内屏障 Cellular uptake 小窝蛋白介导内吞过程选择合适的靶向因子能够特异性的介导载体通过小窝蛋白途径进入细胞，成为研究

13、的热点环形RGD肽介导聚合物胶束通过小窝蛋白途径进入细胞Oba M, et al. Mol Pharm.2008;5(6):1080-92.2.2 胞内屏障 Cellular uptake 本课题组研究发现，cNGR可以介导载基因 PLA-PEG 纳米粒通过小窝介导内吞途径进入细胞Liu C, et al. J Control Release.2011;151(2):162-75.2.2 胞内屏障 Cellular uptake 2.2 胞内屏障Endosomal escape目的基因被输送至靶细胞后 , 一般是通过内吞方式进入细胞 , 并存在于内吞小泡 (endosome) 中 内吞小泡可以

14、将内容物释放至溶酶体中 , 后者有丰富的酶系统 , 可使 DNA 降解破坏目的基因必须从内吞小泡释放进入胞浆 , 并最终进入细胞核中才能实现基因的表达 2.2 胞内屏障Endosomal escape三种内吞体逃逸的机制：(a) Pore formation成孔肽可诱导膜的弯曲和连续性，从而形成膜孔并促进胞内容物的释放。2.2 胞内屏障Endosomal escape(b) Flip-flop.阳离子脂质体与内吞体质膜结合阴离子脂质与阳离子脂质形成复合物诱导质膜中阴离子脂质从胞浆面向内吞体腔面发生翻转释放DNA进入胞浆2.2 胞内屏障Endosomal escape(b) Proton spo

15、ngeH+和Cl-内流在低pH条件下，PEI发挥质子泵作用内吞体胀裂理想的基因载体必须具备能够将DNA递送进入细胞核的能力三种DNA转运入核的途径：(i) 细胞分裂期，核膜暂时破裂，DNA可以扩散到核区(ii) 9 nm或分子量小于 60 kDa 的分子能通过被动扩散进入核孔(iii) 粒径小于25nm的粒子能通过核孔复合物主动转运2.2 胞内屏障Nuclear entry核孔复合物2.2 胞内屏障Nuclear entry2.2 胞内屏障Nuclear entry外源DNA主动转运进入细胞核和通过核孔复合物增加入核，都是通过特定的入核和出核系统，如核定位信号肽来调节的。NLS-mediate

16、d nuclear import pathwaysExamples of NLSs used in gene delivery2.2 胞内屏障Nuclear entry将NLS连接到非病毒载体的方式:非共价连接离子相互作用序列特异性结合共价连接DNA与核蛋白结合理想的基因传递系统应具备以下重要的性质：携带性能：安全性：缓释作用：稳定性：靶向性能：可促进目的基因从内吞小泡释放进入胞浆 可促进目的基因转运入核 可调控基因输入后在体内的表达能携带足够数量的目的基因对机体没有毒性 、致病性或免疫原性, 具有生物降解性或良好的生物相容性 控制基因的释放 , 延长基因的表达时间 ,改善基因治疗的效果载体系

17、统本身应稳定, 而且要保护携带的基因免受核酸酶等的破坏 可有效地将目的基因输送至靶细胞内 3. Nanoparticles used in gene therapy3.1 Lipid based nanoparticles3.2 Polymer based nanoparticles3.3 Liposome-Polycation -DNA (LPD) nanoparticles 3.4 Multifunctional nanoparticles3.1 Lipid based nanoparticles3.1.1 Cationic lipids3.1.2 Cationic liposomes3.

18、1.1 Cationic lipid阳离子脂类大多是合成的双链季铵盐型两性分子 主要作用就是提供正电荷，增加与 DNA 的缩合 一般化学稳定性较好 ,可以生物降解 ,但均有一定的细胞毒性。 阳离子脂质的一般结构3.1.1 Cationic lipidDOTAP 基因传递中最常用的阳离子脂质3.1.1 Cationic lipid常用的阳离子脂质：LHON3.1.1 Cationic lipid本课题组自行合成的阳离子脂质：低毒、高效LHLNLi P, et al. Nanotechnology, 2011, 22, 245104Liu C, et al. J Colloid & Interfa

19、ce Sci, 2011, 354, 528535Yu W, et al. Pharm Res, 2010, 27 (8):1584-1596Yu W, et al. Nanotechnology, 2009,20:215102 3.1.1 Cationic lipidYuba E, et al, J Control Release.2012;160(3):552- Cationic liposomes 阳离子脂质体 融合脂质体 pH敏感脂质体 阳离子脂质体阳离子脂质体是基因治疗中应用最多的非病毒载体一般由带正电荷的脂类与中性脂类按一定的摩尔比组成。 胆固醇 (Chol) 磷酯

20、酰胆碱 (PC) 磷酯酰乙醇胺 (PE)二油酰基磷脂酰胆碱 (DOPC)二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)中性脂类的作用是稳定脂质双层膜、降低阳离子脂质的毒性、特别是促进脂质体对细胞的渗透。 阳离子脂质体目前，商品化的阳离子脂质体有：Lipofectin 和 Lipofect AMINE, 分别由 阳离子脂质 DOTMA 、 DOSPA 与中性脂质 DOPE 构成 。 DC-Chol/DOPE 脂质体是第一个被批准用于人体临床试验的阳离子脂质体。 阳离子脂质体Cationic liposomes/DNA complexeslipoplexes多层洋葱状结构 融合脂质体融合脂质体 ( fusog

21、enic liposomes) 是在制备脂质体时加入融合剂而获得。常用融合剂包括 PEG 、甘油 、 PVA 、以及重组病毒的细胞膜或某些病毒蛋白。DOPE 也具有融合剂的性质 , 主要用于阳离子脂质体 /DNA 复合物的制备 。 融合脂质体 融合脂质体 pH敏感脂质体PH敏感脂质体(pH-sensitive liposomes)是一种具有细胞内靶向和控制药物(如基因、肽、蛋白质)释放的功能性脂质体。 PH 敏感型脂质体 可由 DOPE 、 Chol 和油酸组成。另外一种构建pH敏感脂质体的方法是在磷脂双层中插入融合蛋白或融合肽。 pH敏感脂质体 pH敏感脂质体3.2 Polymer base

22、d nanoparticles阳离子聚合物 (cationic polymer) 与 DNA 可以在电荷作用下发生缩合 , 形成稳定的复合物(polyplex), 防止 DNA 的降解 , 其大小可在 100 n m 以下 , 表面带正电 , 有利于与靶细胞的 吸附。3.2 Polymer based nanoparticlesCationic Polymers Mediated DNA Delivery3.2 Polymer based nanoparticles3.2.1 Poly(L-lysine)3.2.2 Polyethylenimine3.2.3 Dentrimer3.2.4 Ch

23、itosan3.2.1 Poly(L-lysine)虽然有 4 种带正电的氨基酸 , 用于基因输送的聚氨基酸多为聚赖氨酸 。在 20 世纪60年代就已有文献报道, 是最早用于基因传递的阳离子聚合物之一。优点：PLL具有生物可降解型缺点：无质子泵效应，转染效率低因此往往需要进行一些修饰以改善其性能。 如PLL常被连接靶向配体或抗体，添加氯喹或者共价键合PEG，棕榈酰基团等PLL 的结构 3.2.1 Poly(L-lysine)靶向修饰的聚赖氨酸载体通过受体介导内吞途径进入细胞3.2.2 PEIPEI是一种最常用的阳离子聚合物之一，具有较高体内外转染效率PEI的结构：常用PEI分子量：bPEI:

24、25K; lPEI：22KbPEI lPEI 3.2.2 PEI优点：PEI内部的氨基与末端的氨基可在不同的 pH 下离子化，有较强的缓冲性能，一方面有利于 DNA 的稳定性 , 另一方面，PEI 在酸性条件下构象改变可促进 DNA 从内吞小泡中的释放 商品化：ExGen500 和 jetPEI3.2.2 PEIDNA Transfection Using jetPEI 缺点：PEI的转染效率和毒性均随着分子量的增加而增加，为了获得高效低毒的理想载体，PEI的改造和修饰成为研究的热点解决方式： 降低PEI的分子量，降低毒性：Mw800, 1800等 同时进行结构修饰：PEG修饰，靶向修饰，内部

25、二硫 键修饰等等3.2.2 PEI靶向修饰的PEI载体进入细胞3.2.3 Dentrimer星状树突体 (starburst dendrimeers) 的核心分子至少有三个具化学活性的侧链 , 在这些化学活性部位与其他同样的分子聚合 , 如此反复 , 产生一个类似球型的分枝状聚合物。典型的星状树突体是聚氨基酰胺(polyamidoamine, PAMAM ) 。3.2.3 Dentrimer优点：粒径可控，具有缓冲性能 , 可促进 DNA 从内吞小 泡中释放。 商品：SuperFectTM （6代）缺点：转染效率高，但不能生物降解，具有较高的毒性， 通过修饰来降低毒性Luo K, et al.

26、 Biomaterials.2012 ;33(19):4917- Chitosan优点：天然产物，生物可降解，无毒而备受关注缺点：与PEI，PAMAM，阳离子脂质体相比，转染效率较低目前许多关于壳聚糖衍生物及修饰物的研究，以期提高其靶向性和转染效率：PEG-壳聚糖，三甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖，烷基化壳聚糖，巯基化壳聚糖等等 Chitosan 结构 壳聚糖介导基因传递3.2.4 Chitosan3.3 Liposome-Polycation-DNA (LPD) nanoparticles Leaf Huang 课题组首次提出LPD （脂质体-多聚阳离子-DNA 复合物）是一种新型

27、递送基因的阳离子脂质体它的结构是阳离子脂质体包裹鱼精蛋白/DNA 复合物的阳离子脂质体与传统阳离子脂质体不同的是，DNA在鱼精蛋白的作用下压缩，形成一个紧密的带负电的核，与阳离子脂质体混合后通过自组装过程形成稳定的LPD3.3 Liposome-Polycation-DNA (LPD) nanoparticles LPD形成过程3.3 Liposome-Polycation-DNA (LPD) nanoparticles LPD入胞过程3.4 Multifunctional nanoparticles随着对基因传递过程的深入了解，人们越来越意识到，安全高效的基因传递需要多功能化的非病毒基因载体

28、：如应具有长循环功能、细胞或组织靶向功能、内吞体逃逸功能以及核靶向功能等。3.4 Multifunctional nanoparticles显然，在一种单一的载体上有效实现上述功能非常困难。因此，如何将各种功能化的材料组装于同一基因载体中是目前非病毒基因载体研究的热点和难点之一。程序组装是实现载体多功能化的主要手段PIC micelleadsorptionfirst layeradsorptionsecond layerMultilayered vectorLbL(layer by layer):Copolymer self assembly:Lipid incorporation:常用的程序

29、组装有：Targeting ligandPEGLiposomeTargeting liposome3.4 Multifunctional nanoparticles3.4 Multifunctional nanoparticles3.4.1 Multilayered nanoparticles3.4.2 Polyion complex (PIC) micelle3.4.3 Multifunctional envolope nano device (MEND)3.4.1 Multilayered nanoparticles利用层层(layer-by-layer LbL)自组装技术，可以在分子水平

30、上构建超分子结构的多功能纳米基因载体，特别适用于基因转染的研究。 该方法具有操作简便、避免使用有机溶剂、组装程序可控等优势而受到更多的关注。adsorptionfirst layeradsorptionsecond layerMultilayered vectorpolyanionCentrifugeRemoveSuper.Rrinse and ResuspendCentrifugeRemoveSuper.RrinsepolycationResuspend3.4.1 Multilayered nanoparticles自组装基本过程Pro/DNAProDNADNA/Pro/DNA(DPD)DN

31、ACLDPDCationic liposomes(CL)pH7.4CMCS-CLDPDCMCS本课题组构建的多功能CMCS-CLDPDLi P, et al. Int J Nanomedicine.2012;7:925- Polyion complex (PIC) micelle聚离子复合物胶束（PIC 胶束）由一种带电荷的聚合物链和另一种不带电荷的亲水性聚合物链共聚而成，形成核-壳结构的胶束时，载体材料中带电荷的链与带相反电荷的药物通过静电作用聚集形成胶束的内核，不带电荷的亲水性链伸展并围绕在内核的周围形成胶束亲水性外壳。PIC micelle构成大分子胶束的聚合物可生物降解

32、，毒性低，安全性好 由于肿瘤细胞具有高通透性和高截留性，使PIC胶束本身具有被动靶向性，同时通过对胶束表面亲水段末端引入功能基团进行修饰，可使PIC 胶束具有主动靶向性3.3.2 Polyion complex (PIC) micellePIC胶束的独特优势：载药过程基本在水溶液中进行、避免有机溶剂的使用及可以消除溶剂残留引发的毒副作用胶束的外壳隔离了疏水内核与外部介质，增加所载物质稳定性的同时，降低了药物对正常器官和组织的毒副作用利用静电力作用的自组装过程，制备方法简单PIC胶束环状PEG修饰PIC胶束脂质修饰PIC胶束Sun X, et al. Int J Pharm. 2012 ;425(1-2):62-72.Fu C, et al. Int J Mol Sci. 2011;12(2):1371-88.本课题组构建多种PIC胶束用于基因递送3.3.2 Polyion complex (PIC) micelle3.4.3 Multifunctional envolope nano device (MEND)多功能纳米信封: 是在LPD基础上发展起来的日本北海道大学MEND的形成过程多层MEND的形成过程4 Challenges and prospects到目前为止 , 非病毒基因输送系统都并不十分理想 , 总有一些不足之处 , 需要进行优化与完善。提高靶向