流式细胞基本原理和在白血病中应用课件

1、流式细胞学在血液病中的临床应用（基础篇）1流式细胞学在血液病中的临床1流式细胞术的基本概念流式细胞术是一项集激光技术、流体力学技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技技术。快速、准确、客观，多参数，可同时对特定群体加以分选。研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。 是当代最先进的细胞定量分析技术 2流式细胞术的基本概念流式细胞术是一项集激光技术、流体力学技术白血病和淋巴瘤的免疫分型微量残留白血病细胞检查阵发性睡眠性血红蛋白尿多发性骨髓瘤干细胞计数肿瘤细胞的周期和倍体分析网织红细胞和网

2、织血小板计数免疫状态监测血小板功能及相关疾病HLA-B27流式细胞仪的临床应用3白血病和淋巴瘤的免疫分型流式细胞仪的临床应用3标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他血清或各类体液样本。肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为4872小时；EDTA抗凝标本，存放时限只有12 24小时，因为髓细胞在此条件下会裂解；4标本来源：4直方图 散点图二维等高图密度图常见的几种流式细胞图5直方图 散点图二维等高图密度图常见的几种流式细胞图5 设 门淋巴细胞亚群6 设 门淋巴细胞亚群6一：白血病免疫分型7一：白血病免疫分型7白血病诊断依赖于多种检测方法样本形态学流式细胞术细胞遗传学/FISH分

3、子生物学 基础和金标准 必需 重要8白血病诊断依赖于多种检测方法样本形态学流式细胞术细胞遗传学/急性白血病免疫分型的价值区分淋系、髓系白血病区分淋系白血病中的T、B-ALL鉴定混合细胞性白血病的类型： T-M、B-M、T-B、T-B-M治疗过程中监测MRD，评价疗效提示某些遗传学异常： CD19+AML-t(8;21)； CD13+CD33+B-ALL-t(9;22)提示预后： CD56等阳性的AML患者预后不良 CD15阳性的AML患者CR率高9急性白血病免疫分型的价值区分淋系、髓系白血病9正常造血细胞各系列抗原表达的演进不 管 是 在 胚 胎 期 、老 年 期 、还 是 化 疗 以 后，正

4、 常 造 血 细 胞 抗 原 组 合 的 表 达 模 式 都 不 改 变。 10正常造血细胞各系列抗原表达的演进不 管 是 在 胚 胎 期 白血病细胞表面抗原异常表达 造血细胞抗原组合的表达模型能够用于鉴别恶性克隆!白血病克隆与正常细胞之间抗原表达不同-白血病相关的免疫表型 （LAIP）11白血病细胞表面抗原异常表达 造血细胞抗原组合的表达模型能正常造血细胞 白血病细胞抗原表达遵循系列保守性 出现抗原跨系表达髓系:CD33+,T系:CD7+ 髓系: CD33+ CD7+抗原表达有一定的时序性 出现抗原时序混乱表达原始细胞:CD34+CD15- 原始细胞:CD34+CD15+各阶段细胞按一定的比

5、例分布 出现分化阻滞原幼细胞20% 抗原表达的缺失 抗原强度的异常 12正常造血细胞 白需要掌握正常造血细胞的抗原表达规律不同系列的细胞表达的抗原？同一系列不同阶段的细胞表达的抗原？每种抗原的表达强度？13需要掌握正常造血细胞的抗原表达规律13免疫分型常用的抗体干祖细胞 CD34、 TDT、 CD117 、 CD38、HLA-DR、AML CD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO怀疑M6加做CD71、GPA怀疑M7加做CD61、CD41、CD42B-ALL CD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79aT-ALLCD10、CD3、CD4、

6、CD8、CD2、CD5、CD7、 CD1a、cCD3NK细胞CD16、CD56、CD57浆细胞CD38、CD138、c、c、CD19、CD5614免疫分型常用的抗体干祖细胞14根据骨髓细胞CD45/SSC 图中分布情况设门圈定各类细胞R1 门为成熟淋巴细胞R2 门为正常单核细胞位置R3 门正常粒细胞位置R4 门为幼稚淋巴细胞出现位置R5 门为有核红细胞或细胞碎片位置R6 门为幼稚髓细胞出现位置白血病细胞通常会在R4 R6 两门位置处出现正常成人骨髓样本-CD45设门15根据骨髓细胞CD45/SSC 图中分布情况设门圈定各类细胞正AML-M116AML-M116AML-M217AML-M217A

7、ML-M318AML-M318结论：ANLL,建议结合染色体和分子生物学和形态学诊断M3。 19结论：ANLL,建议结合染色体和分子生物学和形态学诊断M3。结论：ANLL，伴单核细胞分化，免疫表型符合M4。20结论：ANLL，伴单核细胞分化，免疫表型符合M4。20结论：ANLL，伴单核细胞分化，免疫表型符合M5。21结论：ANLL，伴单核细胞分化，免疫表型符合M5。21结论：ANLL，建议结合形态学以确诊M6。 22结论：ANLL，建议结合形态学以确诊M6。 AML-M723AML-M723B-ALL24B-ALL24T-ALL 25T-ALL 25EGIL Scoring System Fo

8、r BAL(2points)ScoreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/6426EGIL Scoring System For BAL(2Requirements for assigning more than one lineage to a single blast populationMyeloid lineageMyeloperoxidase (flow c

9、ytometry, immunohistochemistry or cytochemistry) orMonocytic differentiation (at least 2 of the following: NSE,CD11c,CD14,CD64,)T lineageCytoplasmic CD3 (flow cytometry with antibodies to CD3 epsilon chain; immunohistochemistry using polyclonal anti-CD3 antibody zeta chain, which is not T-cell speci

10、fic) orSurface CD3 (rare in mixed phenotype acute leukemia)B lineageStrong CD19 with at least 1 of the following strongly expressed:CD79a,cytoplasmic CD22, CD10 orWeak CD19 with at least 2 of the following strongly expressed:CD79a,cytoplasmic CD22,CD10MPAL (mixed phenotype acute leukemia) WHO 200827

11、Requirements for assigning morCD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineage ALL)B-negative, CD64+CD14+/-CD33+(MonocyticLeukemia)Two Leukemic PopulationsMonoblastsLymphoblasts结论：急性混合细胞白血病(AM-LL)28CD19+CD22+B-negative, CD64+Two 二.白血病微小残留病灶（MRD）目的：判断预后，指导个体化分层治疗，预测复发29 二.白血病微小残留病灶（MRD）目的：判断预后，指导个B-ALL:多数表达CD34、CD38di

12、m、TDT、CD19、CD10str、CD20,这些标志的任意组合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等，也可加上某些异常标志如 CD13、CD33、CD15即可将ALL细胞与正常骨髓和外周血细胞分开（6080%）。T-ALL:TDT结合T细胞表面标志如CD5或CD3，加上cCD3(90%).30B-ALL:多数表达CD34、CD38dim、TDT、CD1AML:CD34、CD56、CD15在内的多种组合，表达TDT、CD13、CD33与散射光及抗原密度，可确定残留的AML细胞（7080%）31AML:CD34、CD56、CD15在内的多种组合，表达TDLEUKEMIA A

13、T DIAGNOSISNORMALDAY290.039%32LEUKEMIA NORMALDAY290.039%322013.4.21,原始细胞占79.2%2013.5.18，MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD20332013.4.21,原始细胞占79.2%2013.5.18，3434 三.成熟淋巴细胞增殖性疾病35 三.成熟淋巴细胞增殖性疾病35慢性淋巴细胞白血病幼稚淋巴细胞白血病毛细胞白血病脾边缘区淋巴瘤大颗粒淋巴细胞白血病皮肤T细胞淋巴瘤相关白血病 循环淋巴细胞增殖性疾病这类疾病必须有流式细胞术的辅助诊断！36慢性淋巴细胞白血病循环淋巴细胞增殖性疾病这类疾病必须有流式细

14、正常淋巴细胞淋巴细胞增殖性疾病(克隆扩增)TB NKor or 确定克隆来源！37正常淋巴细胞淋巴细胞增殖性疾病(克隆扩增)TB NKor B-LPD:B淋巴细胞出现轻链的单一抑制性表达； T/NK-CLPD:由于缺乏单克隆的标记物，通过FCM诊断成为难点。38B-LPD:B淋巴细胞出现轻链的单一抑制性表达；38正常单克隆双克隆单克隆CD20+细胞39正常单克隆双克隆单克隆CD20+细胞39CD19+淋巴细胞增多的鉴别诊断Dighiero G, Hamblin TJ. Lancet,2008,371(March 22),1017B-LPD (lymphoproliferative diseas

15、e)40CD19+淋巴细胞增多的鉴别诊断Dighiero G, Ha结论： CLL/SLL.41结论： CLL/SLL.41结论：慢性B淋巴细胞增殖性疾病，建议进一步FISH检测t(11;14)以确诊MCL.42结论：慢性B淋巴细胞增殖性疾病，建议进一步FISH检测t(1结论：免疫表型符合HCL,建议结合形态学和临床明确诊断。43结论：免疫表型符合HCL,建议结合形态学和临床明确诊断。4344441、前驱T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤（T-ALL/T-LBL）2、母细胞性NK细胞淋巴瘤3、慢性前淋巴细胞白血病/淋巴瘤（T-CLL/T-PLL）4、颗粒淋巴细胞白血病（T-LGL）5、侵袭性NK细胞白

16、血病（ANKCL）6、成人T细胞淋巴瘤/白血病（ATCL/L）7、节外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL）8、肠病型T细胞淋巴瘤（ITCL）9、肝脾T细胞淋巴瘤10、皮下脂膜样T细胞淋巴瘤11、菌样霉菌病/赛塞里(Sezary)综合征(MF/SS)12、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B细胞, 原发性皮肤型13、周围T细胞淋巴瘤(PTL)14、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITCL)15、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL), T和非T非B细胞, 原发性全身型WHO2008成熟T/NK细胞肿瘤淋巴增殖性疾病分类451、前驱T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤（T-ALL/T-LBL）免疫表型特征

17、46免疫表型特征461.光散射信号的异常：FS 471.光散射信号的异常：FS 472.抗原丢失75成熟肿瘤T细胞会丢失正常抗原CD7是最易发生丢失的抗原CD2和CD5也是经常发生丢失的抗原482.抗原丢失75成熟肿瘤T细胞会丢失正常抗原483.抗原表达异常：如：伴CD10493.抗原表达异常：如：伴CD10494.抗原表达强度异常： 504.抗原表达强度异常： 50正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1肿瘤细胞出现CD4或CD8某一个群体的限制性表达模式： CD4+,CD8- CD4-,CD8+ CD4+CD8+ CD4-CD8- 多见5.细胞群体数量的异常增加以及抗原的限制性表达： 51

18、正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1多见5.细胞群体数量5252常见T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL） 通常CD4+ or CD4+CD8+, PB:55%幼淋细胞杭XX,女/60,结果：异常淋巴细胞占47.4%，表达 CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-占比例47.4%，表型符合T-PLL.53常见T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL）血管免疫母细胞淋巴瘤(AITCL): CD4+CD2+CD5+CD10+CD26-,CD7-,CD3-常见T-CLPD免疫表型54血管免疫母细胞淋巴瘤(AITCL):常见T-CLPD免疫表型患者，丁XX,男/5

19、9 淋巴结骨髓结论:异常T淋巴细胞占78%, 抗原表达异常(CD3-CD4+CD7-CD10+CD2+CD5+), 提示T-CLPD55患者，丁XX,男/59淋巴结骨髓结论:异常T淋巴细胞占78%外周T细胞淋巴瘤（PTCL）骨髓侵犯:CD4+,多数CD7-and/orCD5-常见T-CLPD免疫表型56外周T细胞淋巴瘤（PTCL）骨髓侵犯:常见T-CLPD免疫表成人T细胞淋巴瘤（ATLL）: CD4+CD2+,其他T系抗原可有缺失 部分伴有髓系抗原表达：CD13，CD33，CD15 外周血：多形核淋巴细胞 确诊：HTLV-1基因阳性 常见T-CLPD免疫表型57常见T-CLPD免疫表型57T-

20、LGL CD4+ or CD8+，伴有NK抗原表达CD16+，CD57+，部分CD56+形态学：大颗粒淋巴细胞常见T-CLPD免疫表型58T-LGL常见T-CLPD免疫表型58TCRV限制性表达1.包含24种抗体，两种荧光素，识别70V亚家族；2.在诊断和MRD监测中的作用59TCRV限制性表达5960606161STRUCTURE OF T CELL RECEPTORBecause TCR is a part of CD3 complex, vbeta analysis cannot be used for surface CD3-negative T cells. 62STRUCTURE

21、OF T CELL RECEPTORBe 部分病例运用免疫标记物难以将恶性成熟T淋巴细胞从正常T淋巴细胞中精确鉴别(反应性或克隆性)。原因：1.肿瘤细胞被反应性T细胞掩盖 2.CD8+占优势群体还见于：V感染(AIDS,EBV)，BMT后 临床特点对诊断更为重要！63临床特点对诊断更为重要！63流式诊断NK细胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+,CD122+,CD3-没有特征性抗体区分肿瘤和反应性NK细胞： 数量以及FSKIR：KIRs、CD94/NKG2； 均一性表达KIR同种型 64流式诊断NK细胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+ 四.阵发性睡眠性血红蛋白尿65 四.

22、阵发性睡眠性血红蛋白尿65阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）糖基化磷脂酰肌醇锚（GPI ）连接的锚连蛋白缺乏补体介导的血管内溶血为特征的获得性造血干细胞克隆性疾病磷脂酰肌醇聚糖A(PIGA) 基因突变PIGA 基因突变对补体敏感性增高溶血锚连蛋白：补体调节蛋白CD55、CD59、CD16、CD24、CD14、Flaer等66阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）糖基化磷脂酰肌醇锚（GPI样本收集：优先选择外周血，不推荐骨髓抗凝剂: EDTA、肝素RBC最多可存放至7天WBC必须在48小时内检测（粒细胞上的抗原表达和散射会随着时间而改变）CCS指南推荐对2种细胞系进行检测 标本类型 抗凝剂标本储存6

23、7样本收集：优先选择外周血，不推荐骨髓CCS指南推荐对2种细常规检测：敏感度1%，获取5000个目的细胞高敏检测：敏感度0.01%，获取250，000个目的细胞中性粒细胞：必做红细胞：中性粒细胞检出PNH克隆时必做，或全部标本都做，但单独检测不推荐单核细胞：可提供稳定的结果淋巴细胞：不推荐细胞获取目的细胞68常规检测：敏感度1%，获取5000个目的细胞细胞获取目的细胞抗体的选择仅检测CD55/CD59-不推荐 敏感性：5-10% (Sutherland and al,Cytometry Part B 72B:167-177)Flaer-组成高特异性的 PNH Panel 69抗体的选择仅检测C

24、D55/CD59-不推荐69红细胞分析：优点：与 WBC相比，RBC检测能更好地鉴别II型细胞。缺点：输血和溶血会造成PNH克隆大小检测值偏低。 单检测红细胞不能充分评估PNHI型： 正常红细胞II型：CD59部分缺失的PNH克隆III型：CD59完全缺失的PNH克隆70红细胞分析：I型： 正常红细胞70同个患者的红细胞和粒细胞检测结果粒细胞PNH克隆： 54.5%红细胞PNH克隆：6.1%溶血/输血对PNH克隆大小的影响71同个患者的红细胞和粒细胞检测结果粒细胞PNH克隆： 54.5红细胞分析-抗体选择和分析CD59优于CD55CD59在红细胞上的表达水平远高于CD55 结果分析：PNH细胞

25、比较多时，适合使用直方图异常细胞数少时，适合使用散点图同一个患者，CD59能区分出II型和III型细胞，CD55则不能红细胞PNH克隆很少时，适合散点图分析72红细胞分析-抗体选择和分析CD59优于CD55同一个中性粒细胞和单核细胞都可以检测。不适宜采用淋巴细胞白细胞分析- 检测PNH克隆最好的方法73中性粒细胞和单核细胞都可以检测。白细胞分析- CD59最早用于检测粒系PNH克隆的标记物FLAER -能和WBC上所有的GPI锚连蛋白特异性结合：当前成为最佳标记物CD14是表达在单核细胞上的GPI锚连蛋白，用于检测单核细胞的PNH克隆。CD24是表达在粒细胞上的GPI锚连蛋白，用于检测粒细胞的

26、PNH克隆。白细胞分析- 检测PNH克隆最好的方法74CD59最早用于检测粒系PNH克隆的标记物白细胞分析-什么是FLAER? FLAER (FLuorescent AERolysin），荧光标记的嗜水气单胞菌溶素，它不是单克隆抗体，而是灭活的细菌蛋白质，能和WBC上所有的GPI锚连蛋白特异性结合。FLAERCD24FLAERCD1475什么是FLAER? FLAER (FLuorescent AICCS PNH指南:WBC检测的组合Colors细胞类型1234563 colorGFLAERCD24CD153 colorMFLAERCD14CD334 colorGFLAERCD24CD15CD454 colorMFLAERCD14CD33CD454 co