荧光定量PCR技术-讲座0515课件

1、实时荧光定量PCR技术的原理、应用及实践(Real time Quantitative PCR)Real time Quantitative PCR 基 本 原 理Company name 基本原理Company nameReal-time qPCR的定量原理2Real-time qPCR的检测方法3Real-time qPCR的基本概念1Real-time qPCR的解析方法4Real-time qPCR的计算方法5Real-time qPCR的定义Company name实时荧光定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现

2、对起始模板的定量分析。 Real-time PCR仪 ABI7500PCR：基本原理Denaturation: 94 96CAnnealing: 50 65CExtension: 70 75C基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or TCompany name 与普通PCR的比较S形曲线，具有平台效应终点检测法反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量 定量原理Company name理想的PCR反应： X=X0*2n实际的PCR反应： X=X0 (1+E

3、x)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) Ct+ log M (3) log(1+Ex) Ct=- log X0 + log M Ct=-klogX0+b Company nameCompany name 每个模板的 CT 值与该模板的

4、起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。确定初始模板的浓度 定量原理Ct=-klogX0+breal-time qPCR使确定模板初始数量成为可能11实时荧光定量PCR中的三个概念1扩增曲线 (primary curve)2荧光阈值（threshold)3CT 值(Cycle Threshold) 扩增曲线 (primary curve)Company name荧光基团荧光检测元件扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光增长曲线图横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 Compa

5、ny name 荧光阈值（threshold)是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在PCR反应指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。阈值线 原则：1）要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值； 2）同时要尽量选择进入指数期的最初阶段 CT 值(Cycle Threshold)Company nameCt值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value Company nameCt值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 检测方法Co

6、mpany name非特异性荧光标记： SYBR Green I特异性荧光标记：水解探针： TaqMan非水解探针：Molecular beacon 17 解析方法2标准曲线分析1融解曲线分析3绝对定量和相对定量Company name将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)Tm值确认PCR反应的特异性融解曲线分析Company name融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确融解曲线分析Company name 初始模板量的对数与循环数（Ct值）呈线性关系，就可以制作以起始拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。荧光

7、强度-循环数曲线初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线.未知10410310610510210标准曲线分析计算样品的起始拷贝数已知基因拷贝数的标准品建立标准曲线关键： DNA的精确定量绝对定量Sample2522 相对定量表达量校正样品量内参beta-actin、GAPDH基因、 rRNA等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小目的基因/内标基因，均一化为每个细胞或基因组对应的目的基因数量以各自样本中内参基因为标准，比较不同样本中目的基因的相对表达丰度23相对定量的数据处理Ct CtPfaffl ModificationVandesompele Method非均一

8、化的需要后续的均一化以内参基因作为标准目标样品的相对定量通过内参基因的相对定量进行均一化只有一个内参基因假设扩增效率为100%扩增效率不同只有一个内参基因扩增效率不同多个内参基因简单复杂 比较Ct法 2 -CtFold induction = 23 = 8Company namesample内参目的基因Tissue #1: 2122Tissue #2: 20 241st Delta Ct #1:22-21 = 1 Ct #2:24-20 = 42nd Delta Ct:4-1 = 3相对定量方法 Ct存在的问题Company name成立条件：假设扩增效率为100%满足条件：1）内参基因和目标

9、基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率为90%-110%相对定量方法 实 验 流 程Company name 应 用 定量 基因表达水平检测定量 基因拷贝数检测多色标记 SNP检测高精度溶解曲线分析（HRM）- SNP高精度溶解曲线分析（HRM）- DNA甲基化分析 基因表达水平检测 Company name样本处理RNA提取qPCR数据分析实 验 流 程逆转录 样本处理与RNA提取外界刺激 可检测的表达改变样品离开定义环境 裂解、固定细胞Trizon 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS）液氮RNA保存液 小心DNA污染！使用DNase 以RNA作PCR阴性对照 CW0580

10、 CW0592 逆转录逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？检测灵敏度是否足够？是否会有二级结构干扰？ 一步法还是两步法？两步法： 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。推荐：工作的初期阶段 RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段 RealSuper 一步法荧光定量

11、PCR试剂盒/With ROX Master mix的优化Hotstar化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟Fast Hotstar抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒 CW0696 CW0704热启动DNA聚合酶 反应条件优化内参基因单一特异性产物反应效率90%-110% 反应条件优化目的基因单一特异性产物反应效率接近内参基因反应效率尽量高 内参基因 高丰度 ACTB，GAPDH中等丰度 beta2M低丰度 HPRT136扩增产物设计原则二级结构颈环结构片段长度75-200bp最佳长度80-120bp有限的二级结构二级结构的预测用mFold /mfold/applications引

12、物避免位于颈环结构上总原则与普通PCR相同 二级结构Company name扩增产物的二级结构引物避免位于颈环结构上Company name引物的位置Company name556065温度对二级结构的影响Company name实 践Company name实 践内参基因的标准曲线的绘制与数据分析Company name样本：293T细胞株 人提取方法：Trizon RNA 提取试剂 CWBIO 公司 CW0580说明书2106 个细胞总RNA 琼脂糖凝胶电泳图RNA提取Company name逆转录：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒 CWBIO 公司 CW0744说明书取5ul

13、扩增产物，用1.7%琼脂糖凝胶进行电泳体系：2 TaqMasterMix 10ulGAPDHF引物（10um）0.5ulGAPDHR引物（10um）0.5ulcDNA 1u加入灭菌水至20 ul。逆转录Company name模板 cDNA模板稀释倍数10000倍1000倍100倍10倍引物内参基因引物 模板反应体系的配置cDNA 模板 2.0l正向引物F(10M) 0.5l反向引物R (10M ） 0.5lREALSYBR Mixture(2) 10.0lddH2O 7.0lTotal 20.0lCompany name注意：1、为了避免加样误差，做预混体系 2、充分混匀，如有气泡短暂离心Company name95 5min95 10-15sec60 20-30secPlate readGo to 2 for 39 cycles moreMelting curve analysis: from 72 to 95, read every 0.2 , hold