离子交换层析实验报告

1、离子交换层析实验报告实验目的和要求：1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析别离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法实验内容和原理：1、离子交换层析由于蔗糖酶的pi偏酸性，所以在ph7. 3缓冲液的环境中，粗别离纯化样品 蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附， 然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中 和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱 下来，从而到达别离蔗糖酶的目的。2、酶活力检测实验材料和主要仪器：1、实验材料蔗糖酶粗别离纯化(溶解即为样品注2、实验试剂(1)

2、deae-sepharose fast flow(220mmol/l tris-hcl ph7. 3 缓冲液(3)20mmol/l tris-hcl (lmol/1 nacl) ph7. 3 缓冲液(4) 0. 2mol/l 乙酸 缓冲液,ph4.5(55%蔗糖溶液(6)3, 5-二硝基水杨酸试剂3、实验仪器(1)高速冷冻离心机(2)层析柱(1. 0X20cm (1 支/组(3) aktatm start (1 套/组)(4)局部收集器及收集试管(4ml/管)(1台/组)(5) 20冰箱保存样 品用)(6)微量移液枪200ul、lOOOul(7) 1.5ml离心管1留样品出和样品iv用(8)

3、7nli离心管(留样品iv用)(9)恒温水浴(50、100)(10)试管、移液管、试管架等实验方法和步骤：1、仪器连接(1)接通各仪器电源，将a, b泵头分别放置a, b两个溶液瓶中。注意b为 含nacl溶液。(2)点击电脑桌面上unicorn软件图标，翻开软件。选择system control，点击ok,进入操作界面。点击connect(3)在操作界面的工具栏，点击mannual runo出现flowrate窗口，调节 flowrate 为 Iml/min,确定。2、装柱与平衡(1)检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。(2)程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器(mixer)相连

4、，下端 接头与样品阀(sample valve)相连。(3) buff era 平衡一个柱体积(约 20nli=20min)3、加样停止加入20mmol/l tris-hcl ph7. 3缓冲液。待缓冲液液面与胶体外表相切 时，程序暂停pause。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将5ml蔗糖酶蛋白样品 溶液样品道)加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。程序 继续continue,使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，程序暂停 pause,用少量洗脱缓冲液将剩余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体 后，再加缓冲液至一定高度。4、洗脱(梯度洗脱法)(1)加样后，先用buff

5、era进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白(20min 左右)；(2)待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏 manual -* executemanual instruction - pumps f gradient, 在两个框内均 填入100,点击insert,最后点击一次execute,开始梯度洗脱。每2min接一 管，当conductivity上升至8 ms/cm时，开始测定各管的蔗糖酶活力；(3)将蔗糖酶活力高的假设干管酶液(2-3管)合并，测量总体积v4 (样品iv), 样品用7ml离心管一 20c保存。5、蔗糖酶活力检测实验数据记录和处理：上次实验粗提取的蔗糖酶

6、蛋白溶液v3=12. 3ml本次实验加样的蔗糖酶蛋白溶液v3 =5. oml蔗糖酶活力高的两管酶液合并 后 v4=4. oml实验结果和分析：1、洗脱曲线(1) uv曲线在55-70min时，uv曲线有两个峰值，这是未被凝胶吸附的杂蛋白的表达。 85-95min的峰值性状较为“规准”，但经过活性检测发现为杂蛋白。3105-120min有一个峰值较小的峰，经过活性检测其中含有活性较高的蔗糖 酶。(2)在73min左右，buffervalvc b的值瞬间上升，这是由于操作失误导致 的。当时直接把buffer valve的阀门由a转换到b,而没有一个梯度的上升。但好在及时止 损，开始了正确的操作。正

7、确操作：”在程序主界面的工具栏manual -* execute manual instruction pumps gradient,在两个框内均填入 100,点击 insert,最后 点击一次execute,开始梯度洗脱。”(3 ) conductivity的值随着buffer b浓度的增长而增长导电性增加。2、蔗糖酶活力检测比照图如图示，从左到右，第3管和第5、6管都分别有较深的颜色(由于手机、 光线等原因，图示颜色比实际颜色要浅，实际颜色更深)，说明在对应的两个时 间段内洗脱出活性较高的蔗糖酶。实验讨论和心得:1、如上所述，在层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定后进行buffer b 的梯度洗脱时，进行了错误的操作(直接将buffer valve的阀门由a转换到b), 这导致了 buffer b浓度的突然上升，在之后一段时间内，较高浓度的buffer b 可能将柱上局部蔗糖酶与杂蛋白一起洗脱下去，导致之后的第一个峰没能够检测 出目标蛋白。2、什么是梯度洗脱？梯度洗脱(gradient elution)又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析 周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。在同一个分析 周期中，按一定程度不断改