不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链功能及自由基代谢影响

1、Effects of Different Training Intensity onFunctions of Respiratory Chain and FreeRadical Metabolism in MyocardialMitochondria of Rats Huang Caiyun Northwest Normal University西北师范大学研究生学位论文作者信息 论文题目论文题目不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链功能及自由基代谢的影响姓 名黄彩云学 号2021210706专业名称运动人体科学辩论日期2021 年 5 月联系 E_mail通信地址( )：备注：目录摘要.IAbs

2、tract .IV1 文献综述 .11.1 运动对线粒体呼吸链功能的影响 .11.2 运动对自由基代谢的影响 .32 选题依据 .83 实验对象与方法 .103.1 实验对象及分组 .103.1.1 实验动物 .103.1.2 适应性训练及动物筛选 .103.1.3 动物分组及训练安排 .103.2 实验取材及线粒体制备 .113.2.1 心脏取材 .113.2.2 心肌线粒体的提取 .113.3 测试指标及方法 .113.3.1 线粒体蛋白质含量的测定 .113.3.2 NADH、DCPIP、细胞色素 C 消光系数的测定.123.3.3 线粒体呼吸链酶复合物活性的测定 .133.4 自由基代

3、谢相关指标的测定 .143.4.1 超氧化物岐化酶SOD，superoxide dismutase活性测定 .143.4.2 谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX活性测定 .153.4.3 过氧化氢酶CAT的活性 .153.4.4 丙二醛含量MDA测定 .163.5 药品和试剂 .163.6 实验仪器 .163.7 数据统计与处理 .173.8 实验技术路线 .174 实验结果 .184.1 不同训练强度对大鼠体重的影响 .184.2 测试样本蛋白质的含量 .184.3 不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性的影响 .194.3.1 不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性的影响.19

4、4.3.2 不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性的影响.214.3.3 不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性的影响.224.3.4 不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性的影响.234.4 不同训练强度对大鼠心肌自由基代谢水平及抗氧化酶的影响 .244.4.1 不同训练强度对大鼠心肌组织 SOD 的影响 .244.4.2 不同训练强度对大鼠心肌组织 GSH-PX 活性的影响 .254.4.3 不同训练强度对大鼠心肌组织 CAT 活性的影响 .264.4.4 不同训练强度对大鼠心肌组织 MDA 含量的影响 .275 分析与讨论 .295.1 不同训练强度对大鼠体重的影

5、响 .295.2 不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性的影响 .295.3 不同训练强度对大鼠心肌组织自由基代谢相关指标的影响 .325.3.1 不同强度训练对大鼠心肌组织 SOD 活性的影响 .335.3.2 不同强度训练对大鼠心肌组织 GSH-PX 活性的影响.345.3.3 不同强度训练对大鼠心肌组织 CAT 活性的影响.355.3.4 不同强度训练对大鼠心肌组织 MDA 含量的影响.366 结论 .38参考文献 .39致 谢.47摘要实验目的：通过研究不同强度训练模式对 Wistar 大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性、心肌自由基代谢及其抗氧化能力 (SOD、CAT、GSH-P

6、x 活性和MDA 含量)的影响，从线粒体呼吸链活性的运动适应性变化和心肌抗氧化能力变化两个角度探索不同强度的递增负荷运动训练后心肌可能出现的机制，以期为运动健身和合理体育锻炼提供理论依据。实验方法：本实验参照 Bedford 报道的渐增负荷跑台运动模型及丁树哲的运动负荷标准，将筛选出的 50 只雄性健康 Wistar 大鼠共设为 5 组，即：(1)安静对照模式 CK (常规饲养不运动)；(2)低强度训练模式 LT (强度相当于 55%VO2max)；(3)中等强度训练模式 MT (强度相当于 75%VO2max)；(4)高强度训练模式 HT (强度相当 85%VO2max)；(5)极高强度训练

7、模式 HE强度相当于 92%VO2max。每组随机选择 10 只 Wistar 大鼠进行不同强度模式训练，训练 8 周，1 周训练 6天，1 次/d。八周训练结束后，在空腹状态下分批麻醉大鼠后剖腹迅速取出各个模式组大鼠样本心脏，进行线粒体呼吸链酶复合物、活性，心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX) 、过氧化氢酶CAT的活性及丙二醛(MDA)含量的测定。线粒体呼吸链酶复合物、活性用紫外分光光度法测定；抗氧化酶 SOD、GSH-PX、 CAT 活性和 MDA 的含量的测定所使用的试剂盒均购自南京建成生物，操作严格按照试剂盒说明书进行。实验结果1经过 8 周不同强度训练

8、，不同训练强度模式大鼠体重均有变化，与安静对照模式 CK 相比，极高强度训练模式 HE 降低幅度最大，中等强度训练模式MT 次之。2本实验研究结果说明，不同训练强度对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性均有不同程度的影响。与安静对照模式 CK 相比， MT 和 HE 模式对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性均有极显著差异，分别升高 168.21%和137.77%，而 LT 和 HT 模式均降低，分别降低 6.03%和 10.07%；HT 模式与 HE模式对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性均有降低作用，分别比对照降低66.79%和 6.57%，而 LT 模式与 MT 模式对大鼠心肌线粒体呼吸链酶活性均

9、有升高，分别比安静对照模式 CK 升高 3.65%和 55.47%；MT 和 HE 模式的酶复合物活性均极显著升高，较 CK 分别升高 275.38%和 218.15%，而高强度训练模式IHT 却降低了 20%；与安静对照模式 CK 相比，大鼠心肌线粒体呼吸链酶活性均有不同程度的变化，其中以极高强度训练模式升高幅度最大(223.99%)，中等强度训练模式 MT 升高幅度最小(57.28%)。3随着训练强度增加，SOD 活性呈先上升后下降的趋势，具体表现为HT(14.16)MT(11.78) LT(11.08)HE(10.92)。与大鼠安静对照模式 CK 相比，中强度训练模式 MT 和高强度训练

10、模式 HT 的心肌组织超氧化物歧化酶 SOD 表现为上升现象，分别较对照 CK 升高 6.1%和 27.5%，而低强度训练模式 LT 和极高强度训练模式 HE 却表现为降低效应，较对照分别降低 0.3%和 1.7%。模式间均存在显著或极显著差异(P0.05 或 P0.01)。4随着训练强度增加，大鼠心肌组织 GSH-PX 活性亦呈先升后降的趋势，具体表现为 HT(104.865)MT(104.229) LT(82.672)HE(72.177)。与安静对照模式 CK 相比拟，MT 和 LT 均表现出增加效应，分别较对照 CK 增加 21.05 和21.69，而 HT 和 HE 却表现相反的效果，

11、分别较对照 CK 降低 0.51 和 11.0。除低等训练强度 LT 外，其余不同强度训练模式与安静对照模式 CK 大鼠均存在显著或极显著差异(P0.05 和 P0.01)。不同训练强度模式间均存在显著或极显著差异(P0.05 和 P MT (11.78) LT (11.08) HE (10.92). Compared toCK, SOD in medium intensity training mode (MT) and high intensity training mode(HT) was higher6.1% and 27.5%, respectively. And the inten

12、sity of low trainingmodel (LT) and extremely high intensity training (HE) has reduced t by 0.3% and1.7% respectivelyand there was significant or highly significant difference betweenmodes (P0.05 or P0.01).(4) With the increase of training intensity, GSH-PX activity of myocardial tissuein rat dropped

13、 first and then rose.viz, HT (104.865) MT (104.229) LT (82.672) HE (72.177). GSH-PX activity in both MT and LT was higher 21.05 and 21.69 thanthat in CK, respectively. But the HT and HE showed the opposite effects, waslower0.51 and 11.0 than that in CK, respectively. In addition, there was significa

14、nt orhighly significant difference (P0.05 or P0.01) between the different trainingintensity treatments.(5) With the intensity training increasing, the experimental results show thatCAT activity gradually increased when training intensity reached 85% of maximumVoxygen consumption CAT maximum, then de

15、clinedwith increasing training intensity.There are significant or very significant differences between different intensitytraining treatments and CK (P0.05 or P0.01). The activity of CAT different trainingintensity.the differencr value between the training intensity and CK showed HT(0.294) MT (0.223

16、) LT (0.178) HE (0.093). There were significant or extremelysignificant differences between the different training intensityexcept the LT and MT(P0.05 or P0.01).(6) There were significant and highly significant differences (P0.05 or P0.01)between different intensity training model and CK. MDA conten

17、ts in LT, MT and HTtreatments significantly increased by 50.20%, 11.11% and 71.74% respectively, whileHE decreased 3.90%. There are significant and highly significant differences amongdifferent training intensity (P0.05 or P0.01).Conclusion:(1) After eight weeks of different strength training, four

18、different trainingintensity mode amplitude weight gain was significantly lower than that of controlmode, embodied in: HT HE LT MT, the high growth rate of body weighttraining mode, extremely high-intensity mode has affected the normal growth of ratbody weight growth, inhibit the natural growth of bo

19、dy weight in rats.(2) Different training intensity pattern will cause respiratory chain function in ratwere increased, but different training patterns at different levels to improve thefunction of mitochondrial respiratory chain were difference. moderate intensitytraining mode in the enhancement of

20、rat myocardial mitochondrial respiratory chainenzyme function, improve the mitochondrial ATP synthesis capacity than the highand training mode、high intensity training mode and low intensity training mode.(3) Different intensity training on rat myocardial tissue antioxidant capacity willimpact, moder

21、ate intensity training mode and the high intensity training in improvingthe antioxidant capacity was significantly higher than that of low intensity trainingmode and high intensity training mode, extremely high-intensity mode can reduce thelipid peroxide the MDA content.Key words: myocardium, mitoch

22、ondrial, respiratory chain, enzyme complexs, SOD,GSH-PX, CAT, MDAVI1 文献综述线粒体是真核细胞中最重要的细胞器，其一般分布在功能比拟旺盛的组织细胞区域内，比方像心肌、肾脏、肝脏和肠表皮等大量耗能细胞中，其含量非常高。线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，在细胞代谢和能量产生过程中扮演着重要的角色，它是心肌细胞内三羧酸循环、呼吸及合成高能磷酸化合物最旺盛的部位，对缺血、缺氧也最敏感，是大多数活细胞中心代谢途径的核心，也是线粒体进行电子传递或者说是线粒体呼吸的过程，此过程将会由于耗氧而产生大量的氧自由基或活性氧(ROS)，主要包括超氧阴

23、离子(O2-)和羟自由基(OH)。运动是促进心脏健康的重要手段之一，但运动强度是关系到运动平安和有效的最重要因素。自 20 世纪 60 年代以来人们一直对线粒体与运动的关系密切关注，有关运动与线粒体结构功能的研究已取得了不少有价值的成果。丁树哲报道疲劳运动中一次力竭跑和游泳后大鼠心肌脂质过氧化水平升高，对细胞膜有损伤作用1发现 90 min 运动后心肌线粒体各项指标未见明显变化而力竭运动后心肌线粒体脂质过氧化水平显著提高，抗氧化能力显著下降。衣雪洁3，4等探讨力竭性游泳造成胃肠功能紊乱的机理发现在运动 30 min 和 60 min 组中，胃、肠 MDA 含量显著增加。王文信等5报道了力竭运动

24、后心肌线粒体游离钙浓度下降，总钙浓度增加的实验结果。田野等6报道了力竭运动后骨骼肌线粒体钙含量显著增加，24h到达峰值，48h 尚未恢复的实验结果。郭勇力等7研究说明力竭运动和过度训练可导致大鼠心肌细胞凋亡数目明显增加，且伴有不同程度的心肌损害，而中等运动强度训练不会引起心肌细胞凋亡增加，分析认为心肌细胞凋亡可能参与由于运动超负荷而致的病理性失代偿心脏转变过程，导致运动性心脏损伤。车力龙8等研究发现，长期耐力运动期间，心肌中脂质过氧化反响较明显，但 NO 和 GSH含量无显著变化。长期运动可增加心脏器官的游离铁含量9-11，游离铁通过 Fenton反响产生羟自由基，致使心肌脂质过氧化水平上升。

25、可见，运动方式、运动强度对心肌线粒体功能的影响不同。1.1 运动对线粒体呼吸链功能的影响1925 年 Keillin 首次提出了线粒体呼吸链的概念。呼吸链是位于线粒体内膜的一个酶体系，承当着电子传递作用，故又被称为电子传递链。线粒体电子传递1 。张钧。张钧2等观察了大鼠 90 min 运动和力竭运动后心肌线粒体脂质过氧化水平，链是由 4 个酶复合体 I，、细胞色素 C、泛醌(辅酶 Q)库以及复体 VH+-ATP 酶等组成。其中复合体(NADHCoQ 复原酶)、复合体(琥珀酸CoQ 复原酶)、复合体 ( CoQ细胞色素 C 复原酶) 和复合体(细胞色素氧化酶) 是构成酶复合物的重要组成局部，其活

26、性变化能直接或间接地反映其线粒体呼吸功能的变化 2。线粒体呼吸链上的酶是由线粒体 DNA (mtDNA)和核DNA(nDNA)所共同编码，但 mtDNA 很容易受到自由基损伤，又缺乏较完善的修复机制，从而引起损伤积累，影响线粒体功能12线粒体氧化磷酸化是机体获得能量的重要来源，细胞所需要的能量 90%是由线粒体氧化磷酸化过程提供的，其过程由线粒体内膜呼吸链完成。线粒体内膜呼吸链根本功能是转换底物的氧化复原势能( Eh)为质子电化学势能( H+)，后者再转化成 ATP 的高能磷酸键能( GP)13-15。在正常生理条件下，线粒体氧化磷酸化过程是与电子传递紧密相偶联的，呼吸代谢之所以能够顺利完成，

27、主要是通过电子传递链有序而逐步地将电子从复原性辅酶传递给分子氧的。电子传递链的作用是使需氧细胞内糖、脂肪、氨基酸等通过各自的分解途径形成复原型辅酶NADH 和 FADH2，在 C或 C的作用下，将其电子通过 CoQ 传给 C，再经细胞色素 C 传给 C，最终复原氧生成水。有关运动对线粒体呼吸链酶活性的多数研究说明，运动至疲劳或力竭状态，大鼠组织(肝脏、心肌和骨骼肌)线粒体态 4 呼吸速率增加，复合体和复合体参与的呼吸链质子漏增加，线粒体无效氧耗增加，H+-ATP 酶合成活力明显下降。陈彩珍等16对不同年龄段小鼠进行有氧运动训练协同抗氧化剂延缓肾脏老化的效果时发现，与 5 月龄小鼠相比，20月龄

28、的老年小鼠肾脏线粒体数量减少、体积增大，呼吸链 NADH 脱氢酶、Cyt-C氧化酶活性下降，但抗氧化酶活性却增大，认为长期进行有氧运动和/补充抗氧化剂可在一定程度上维持机体氧化与抗氧化的平衡，延缓线粒体老化且能改善线粒体功能。而运动对呼吸链酶复合体，因训练模式、强度及研究对象年龄等不同而不同。卢建等17和陈彩珍等18对老年小鼠进行长期性的运动训练后发现：心肌、骨胳肌线粒体复合物活性随年龄增长而降低，但经过 8 个月有氧运动训练的小鼠，心肌线粒体复合物活性显著升高，骨骼肌线粒体复合物及复合物 IV 活性明显升高，显著高于 5 月龄鼠和对照。也曾有人报告称大鼠呼吸链复合体酶的活性可随衰老而下降19

29、，中等强度的耐力运动可预防衰老引起的呼吸链复合体酶活性下降20。曹兆丰21通过耗竭性游泳训练后发现大鼠的心肌、股四头肌、肝线粒体复合物活性显著下降。 Lovlin 等22通过对大鼠2 。一次性力竭运动后研究发现，随着运动时间的延长，线粒体活性氧产生增加，过氧化水平提高，从而使线粒体膜上酶的活性受到影响。急性运动至力竭后线粒体内膜 NADH-CoQ 复原酶活性降低23。颜宜花24等的研究也说明，一次急性运动至力竭，大鼠骨骼肌线粒体内膜 NADH-CoQ 复原酶活性较安静时下降 34.2%，吕梅25和张勇26也发现大鼠力竭性运动后骨骼肌线粒体复合物活性显著下降，说明力竭性运动对肝线粒体膜呼吸链组分

30、复合物构成损害。随后张勇27进一步研究发现：肝组织中 NAD+含量显著下降，MDA 含量升高，复合物活性下降，将阻断三羧酸循环 NADH + H+进入线粒体呼吸链的电子传递过程，使线粒体氧利用率下降。文立28和张勇29等给大鼠补充 CoQ 后观察安静状态及进行跑台三级递增负荷运动时心肌和肝脏线粒体辅酶 Q 含量、MDA 水平的变化，研究发现：与对照组相比，心肌和肝脏线粒体辅酶 Q 含量和 MDA 水平同时增加，提示线粒体辅酶 Q 含量增加促进了自由基的产生。另有实验说明，线粒体辅酶 Q 含量与线粒体自由基的产生呈线性关系30。郭彦青等31研究了有氧运动在中长期耐力运动中对大鼠体内线粒体呼吸链复

31、合体酶，的活性的影响，结果说明，有氧运动在中长期耐力运动中可有效提高大鼠体内线粒体呼吸链复合体酶，的活性，提高其骨骼肌的工作效率和运动持久能力，而无氧运动那么只能在短期内提高呼吸链复合体酶，活性，长期无氧运动那么可能会导致机体疲劳，造成对线粒体呼吸链复合体酶的损伤，从而影响骨骼肌工作效率。也有研究发现大鼠游泳至力竭，细胞色素 c 氧化酶活性下降 25%32。由此可以说明，运动训练使心肌、骨骼肌线粒体呼吸链出现了显著的适应性变化，从而减弱了衰老过程中由于自由基产生增多造成的损伤。1.2 运动对自由基代谢的影响自 1956 年 Harman 首次在分子生物学的根底上提出自由基学说以来，其理论一直备

32、受学术界同仁的关注和重视。自由基是生物体内有关酶系统催化的需氧代谢过程和电子传递链电子传递的中间产物，也是生物体组织或细胞在某些化学损伤过程中形成的中间产物。自由基具有很高的反响活性，它是生物大分子、细胞和生物组织的危险杀手，过多或过少都会造成机体损伤。在正常生理状态下，机体内自由基的产生、利用和去除保持着动态平衡，其浓度很低，不仅不会对机体产生损伤，而且可以显示出独特的生理作用维持机体正常生命活动，但在某3 些病理情况下，自由基的产生和去除失去平衡，不管是因自由基产生过量还是不足，或是机体去除自由基的能力减弱，都会导致疾病的发生或机体衰老，自由基一旦生成便会立即经过其中间代谢产物不间断地扩展

33、生成新的自由基，形成连锁反响。自由基和细胞膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反响后会造成组织损伤，并且会引起细胞功能的代谢发生障碍，细胞受自由基攻击后会引发链式脂质过氧化反应，形成对细胞膜损伤的氧化物或脂质过氧化物。脂质过氧化反响的中间产物丙二醛MDA作为脂质过氧化的主要代表产物，其被作为衡量机体自由基代谢的敏感指标，其含量能客观地反映机体产生自由基的水平。近年来，大量研究证实，运动与自由基代谢有关。具紫勇33等研究认为小运动训练强度对大鼠心肌 SOD 的活力无显著性改变，但能增加大鼠心肌 MDA 的含量，而中、高运动训练强度那么显著降低大鼠心肌 SOD 活力和增加 MDA 的含量。任昭君等34 采用

34、大、中、小 3 种不同强度的运动训练对大鼠自由基代谢进行研究时发现：三种训练强度都能提高大鼠安静状态下心肌、骨骼肌中谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化酶活性，抑制力竭运动导致的机体谷胱甘肽含量的下降。金其贯等35研究发现：大鼠经 8 周运动训练后，过度训练组心肌 MDA 含量显著增加，l 小时训练组心肌 MDA 含量却有下降的趋势。而金花等36通过对大鼠进行为期 11 周的跑台耐力运动训练后研究发现，心肌组织内 MDA 含量有下降趋势。有研究说明大强度耐力训练使抗氧化酶活力升高37;小负荷的耐力训练使MDA 含量下降、SOD 活性升高，使机体的抗氧化能力增强，从而提高了有氧代谢能力及抗疲劳能力38，

35、54。张勇等39也证实了运动过程中有氧代谢增强本身就可以促进氧自由基生成，长期有氧运动可改善机体抗氧化酶活性，减少自由基对机体的损害，起到延缓衰老的作用。史亚丽等40研究说明，有氧运动能够提高心肌细胞抗氧化酶(Mn-SOD、GSH-Px、CAT)活性，从而有效防止自由基损伤，延缓器官衰老，而大强度运动会产生大量自由基，破坏抗氧化酶的活性，产生自由基损伤导致心肌细胞破损. 乔玉成41研究发现，与安静对照组相比，大鼠力竭性游泳后 18 小时心肌 MDA 含量增加了 44.12%，GSH 含量增加了 22.30%，差异显著。杨建昌42等通过观察大鼠游泳至力竭后自由基对红细胞膜的影响时发现：大鼠游泳至

36、力竭后可引起内源性自由基增加，红细胞膜脂质过氧化增强，而韩立明对小白鼠进行 70 min 游泳后发现运动可显著降低小白鼠脑、心、肝、肾、肌组织中的脂质过氧化物(LPO)的生成43。而张钧等观察了大鼠 90 min 运动和力竭运动后心肌线粒体脂质过氧化水平，发现 90 min 运动后心肌线粒体各项指标未4 见明显变化而力竭运动后心肌线粒体脂质过氧化水平显著提高，抗氧化能力显著下降2。丁树哲通过研究疲劳运动中一次力竭跑和游泳后大鼠心肌自由基水平，研究发现脂质过氧化水平有明显提高1。线粒体呼吸链是运动内源性自由基产生的主要来源44，但在正常生理条件下，机体内自由基的生成与去除保持动态平衡，对机体不会

37、造成损害。消除自由基、减轻其危害的物质主要是机体中的抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)等。超氧化物歧化酶(SOD)是体内对抗自由基的第一道防线45，46，其活性越高去除自由基的能力越强。当机体吸入氧气进行新陈代谢时就会产生超氧阴离子自由基，而超氧阴离子自由基在体内会产生连锁反响，破坏细胞结构。而 SOD 对去除体内致病因子超氧自由基有特效。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它能特异催化复原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的复原反响，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用47，而卢文彪

38、等48研究说明 GSH 是人体自身重要的免疫增强剂、抗氧化剂和解毒剂，具有阻止自由基代谢增强的功能。过氧化氢酶(CAT) 广泛存在于哺乳动物体内，尤其在肝脏和红细胞内的含量最多，可以催化两个过氧化氢的氧化复原反响，利用或消除细胞内的过氧化氢和过氧化物，防止其含量过高而对细胞起保护作用，防止损伤生物膜结构和影响生物膜功能。有关不同运动方式对抗氧化酶的影响，国内外报道很多，而且大多数的研究都说明随着运动时间以及运动强度的变化，对抗氧化酶的影响也会不同。黄彬49等研究认为运动训练可以上调组织的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及复原型谷胱甘肽(GSH)的含量，表现出很

39、强的运动适应性。史亚丽50等研究说明运动能起到去除自由基和提高体内抗氧化活性的作用，而关于力竭运动对骨骼肌、心肌、肝、肾脏、胃等组织中抗氧化酶活性影响的研究尚存在争议，但多数研究说明，力竭运动后即刻抗氧化酶活性下降51，52，53，54，自由基增加55-58，但 24h 根本恢复2，而马先英59等采用游泳训练至力竭运动后发现心肌抗氧化酶活性升高。criswell 等60通过 12 周间歇训练运动后发现：大强度短距离高速度间歇训练后骨骼肌抗氧化酶活性的效果较中等强度的持续训练好。关于急性运动对抗氧化酶的影响报告也很多，多数研究说明急性运动可引起心肌、骨骼肌和肝脏等组织 SOD、GSH-Px 等抗

40、氧化酶的活性升高。王安利61等报道小鼠 1 次 90 min 的无负重游泳后即刻，肝脏 MDA 含量、SOD 活性较安静状5 态下是升高的，但 SOD 活性与 MDA 的比值与安静状态比拟是显著降低的，说明虽然 SOD 活性与安静状态比拟是升高的，但 1 次急性运动造成肝脏内脂质过氧化物产生增多超出了其去除能力。强度越大和/或运动持续时间越长，骨骼肌 SOD 和 GSH-Px 活性提高越明显，同时还发现，耐力训练只能提高 I 型和IIa 型肌纤维 SOD 和 GSH-Px 活性62，63。耐力运动主要以有氧耐力为主对体内自由基影响的报告也很多，研究说明耐力运动可使人体和动物运动后血液、肌肉、肝

41、脏等组织器官中自由基和脂质过氧化产物含量减少，自由基引起的损伤程度减轻。也有研究证实，剧烈活动使自由基生成量增加，自由基与病理损伤有关，导致运动性疲劳或诱发某些疾病22。由此提示运动训练并不是完全抑制自由基的产生，而是主要通过提高机体抗氧化能力，即提高去除自由基系统的抗氧化酶活性，从而加快自由基的去除。同时有研究发现运动训练也使人体安静时自由基的生成量减少，并能使人体在运动时自由基的顶峰值降低。金花36等人对大鼠脑和心肌组织自由基进行研究时发现：适量耐力训练可降低大鼠安静时大脑皮层、小脑、心肌超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，降低组织的脂质过氧化水平和减少褐素沉积，

42、说明适量的耐力训练具有一定的抗衰老作用。训练组定量运动即刻 SOD、GSH-Px 升高而对照组下降，且训练组各指标恢复至安静水平所需时间短于对照组，说明训练可提高机体的氧化应激能力，短时间耐力训练不影响心肌过氧化氢酶活性；王安利61等研究发现:有氧训练不仅可以促进体内氧化与抗氧化的平衡向有利于机体的方向开展，而且可以抑制老年肝、肺内因增龄引起的抗氧化能力的下降；有氧运动能够有效地降低机体不同功能状态下脂质过氧化水平和 XOD 的活性，提高 SOD、CAT 的活性，减少自由基对机体的危害64；刘洪珍65等研究不同有氧耐力训练对肌组织自由基代谢和抗氧化系统的影响时发现：经过 7 周跑台训练，SOD

43、 活性无变化，MDA含量下降，差异具有显著意义。郭海英66等和任昭君67等研究发现，耐力训练使大鼠在安静状态股四头肌 GSH 含量不变，肝脏 GSH 含量增加。国外的研究者salminen 等报道，耐力训练提高了骨骼肌中 GSH 浓度。Leeuwenburgh 等 1997年报道了经 10 周耐力训练后，大鼠股外侧肌中的 GSH 含量增加 33%68. 在耐力训练中，机体抗氧化酶活性显著升高，表现为长期耐力训练可使肝脏、心肌、骨骼肌组织中 SOD 活性和 GPX 活性升高40.而郭海英等69研究发现跑台耐力训练11 周 SD 大鼠股四头肌中 MDA 含量无影响，同时观察到 GSH-Px，GST

44、 活性升高。研究也证明：长期有氧训练可以通过抗氧化酶的适应性改变增加线粒体抗氧6 化应激的能力，而过度训练那么因“氧化一抗氧化的失衡损害于线粒体。通过以上研究可以看出，不同训练强度对自由基水平的影响不同，即使同种训练强度不同时刻取样对自由基的影响也不同。因此，制定一种切实可靠的训练方案不仅对减少自由基生成和增强机体抗氧化系统去除自由基的能力具有重要意义，而且能够更好的指导人们进行合理的体育锻炼，从而减少运动疲劳的产生，这也是本实验的研究目的之一。7 2 选题依据心脏是人和脊椎动物的重要器官之一，通过血液循环它不仅可以为机体提供充足的氧气和营养物质，也可以将体内多余的产物如二氧化碳、尿素和尿酸等

45、排出，保证机体细胞正常代谢及各种应激状态下生理功能的正常运行。心脏是机体中耗氧率最高的器官之一，而运动是促进心脏健康的重要手段之一，然而，大量的研究结果说明，运动对心脏的影响有双向效应，适宜强度的运动训练对心脏有促进作用，反之那么会导致心脏结构和功能的损坏。王友华70等采用不同方式的运动训练对大鼠心脏功能进行研究时发现：有氧训练可引起心肌肥大和左心室肥大，并能使心脏功能增强。也有研究发现：有氧运动或中低强度运动会对心脏产生良好效果，如肌纤维增粗、线粒体嵴致密、毛细血管密度增加、心肌收缩力增强等71。而力竭性运动或长期过度训练那么对心脏具有消极的作用，不仅不利于心脏机能的提高，反而会损害其正常机

46、能，使心脏由生理性向病理性转变72。袁海平73等人的研究也证实了这一点，他发现：力竭运动后心肌细胞凋亡增加，并且随着运动负荷的增大，细胞凋亡的百分率也升高，同时还出现心肌细胞严重变性现象以及心肌内部肌纤维断裂，细胞间质减少，线粒体肿胀等心肌损伤的形态学改变，说明超负荷运动可使心肌向病理性失代偿性改变。1899 年，瑞典医生 Henschen 发现运发动生理性增大的心脏可完成大的工作量，从而提出了运发动心脏的概念，并认为“最大的心脏将赢得比赛的胜利，然而，一些著名运发动在运动中或运动后猝死的现象引起了医学界和体育界的关注研究发现：心脏长期过度负荷不仅影响运发动的机能水平，降低其运动成绩，而且对运

47、发动的身体健康损害极大，会给运发动的运动生涯乃至生命平安带来巨大威胁74。一些学者75也认为，在过量运动时和运动后，心脏供血不能满足心脏做功的需要，从而引起心肌损害，引发心功能不全和电的不稳定，严重者猝死由此提出过量运动对心脏有损害，可造成心肌组织结构和心肌功能等方面的病理性变化。心脏不停地收缩和舒张需要的能量大局部来源于线粒体，因此线粒体是心肌细胞非常重要的细胞器之一，研究证实，线粒体对生理和病理性刺激都很敏感，也是细胞中最容易出现变化的细胞器之一适宜的负荷可使线粒体发生良好适应，即数量多，体积大，有关酶的活性高，心脏过度负荷后，线粒体崩解，数量明显减少，并伴有退行性变化及线粒体酶活性的减弱

48、76线粒体不仅是运动能量代谢重要的细胞“动力场，而且也直接参与了 “运动氧应激的代谢和调8 控过程。线粒体呼吸链在合成 ATP 时，可产生氧自由基。在正常的生理状况下，机体内自由基的产生、利用和去除保持着动态平衡，但当机体内自由基产生过多或去除过慢时就会造成机体在分子水平、细胞水平以及组织器官水平的各种损伤，进而加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。近年来，许多学者研究证实，运动与自由基的代谢有关。运动引起组织氧耗的增加可以导致自由基产生的增加，当自由基数量超过体内的抗氧化防御系统去除自由基的能力时，就会导致细胞的损伤，长期会导致炎症、肿瘤等疾病的发生77。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化

49、物酶(GSH-Px) 和过氧化氢酶(CAT)是消除自由基，减轻其危害的，是存在于机体中的主要抗氧化酶，而 MDA 是脂质过氧化物的代表产物，是衡量机体自由基代谢的敏感指标，其含量能客观地反映机体产生自由基的水平。张尧天等78通过对 40 只大鼠进行不同强度的训练后发现急性力竭运动可造成线粒体损伤和心肌损伤，但力竭运动后 24h 各项指标根本恢复。高彩暇79研究说明，一次性长时间运动后，大鼠心肌线粒体抑制活性氧的能力下降，但线粒体呼吸功能完好，认为急性长时间运动产生的氧自由基还缺乏以攻击心肌线粒体。可见，机体心血管系统在运动时变化异常剧烈，但运动对心肌线粒体功能影响因运动强度、运动方式不同而不同

50、，而且大多数人的研究大多集中在急性运动和不同强度的耐力运动，关于不同强度的渐增跑台运动对大鼠心肌线粒体呼吸链和自由基代谢的研究较少，心肌线粒体功能损伤无疑会影响心脏能量的供给，因此，如何适当控制心脏负荷，防止运动中发生心脏的病理性转变，同时又不影响身体运动能力的提高，是运动医学界面临的一个重要研究课题。本文在前人研究的根底上，依据 Bedford渐增负荷跑台运动模型、丁树哲的运动负荷标准，以 Wistar 大鼠为研究对象，研究 4 种不同训练强度模式对大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物活性、自由基代谢、抗氧化酶 (SOD， CAT，GSH-Px) 的活性及 MDA 含量的影响，旨在了解心肌在运动适应

51、过程中线粒体呼吸链功能及其自由基代谢的变化规律，为健身运动和运动训练提供科学依据。9 3 实验对象与方法3.1 实验对象及分组3.1.1 实验动物雄性健康 Wistar 大鼠 60 只，体重 181.610.3g(2 月龄，由甘肃省中医科学院动物实验室提供，动物生产许可证：SCXK(甘)2021-001)，国家标准啮齿类动物，枯燥饲料喂养，自由饮食进水，动物室温度控制在 23-25，相对湿度 40-60，自然采光，饲养室、用具等定期消毒灭菌。3.1.2 适应性训练及动物筛选60 只大鼠购入后在动物房饲养一周，使其适应动物房的环境，一周后所有老鼠分别在跑台上进行为期 2 天的跑台适应性训练，跑台

52、适应的方法：每天进行一次水平跑台，速度由 12m/min 逐渐递增到 25m/min，运动时间 15min。淘汰体重过重或过轻的以及不适应跑台运动的大鼠，根据训练情况筛选出 50 只大鼠为实验研究对象。3.1.3 动物分组及训练安排本文方案设计参照 Bedford 报道的渐增负荷运动跑台模型80及丁树哲81的运动负荷标准，共设为 5 组，即：(1)安静对照模式 CK (常规饲养不运动)；(2)低强度训练模式 LT (强度相当于 55%VO2max)；(3)中等强度训练模式 MT (强度相当于 75%VO2max)；(4)高强度训练模式 HT (强度相当 85%VO2max)；(6)极高强度训练

53、组 HE强度相当于 92%VO2max。每组随机选择 10 只 Wistar 大鼠进行不同强度模式训练，训练 8 周，1 周训练 6 天，1 次/d。具体方案见表 31。表3-1大鼠实验训练方案周次week速度(m/min)LT MT HT HE坡度 时间 速度 坡度 时间 速度 坡度 时间 速度 坡度 时间() (min) (m/min) () (min) (m/min) () (min) (m/min) () (min)12345678810111314151515555555552025303040405060182021232527272755555555202530304040506

54、0182021232527272710101010101010102025303040405060182021232527272720202020202020202025303040405060备注：CK：安静对照模式；LT：低强度训练模式；MT：中等强度训练模式； HT：高强度训练模式； HE 极高强度训练模式。下同。10 3.2 实验取材及线粒体制备3.2.1 心脏取材八周训练结束后，在空腹状态下麻醉大鼠。具体麻醉方法82是：大鼠于实验前禁食不禁水 12h，实验当天禁水。用 0.3%的戊巴比妥钠 1ml/100mg 剂量作腹腔注射，大鼠均到达麻醉状态后放于冰盘上剖腹并迅速取出大鼠心脏。然后

55、将大鼠心脏置于预冷的生理盐水中清洗积血，为尽可能减少残留血液需洗涤三次以上，随后用滤纸吸干并用锡纸包好，置于液氮中冷冻数小时后取出放于-20低温冰箱中保存待测。3.2.2 心肌线粒体的提取将低温保存样本取出在 04放置 10min 后，在冰浴中将心肌剪成碎块，按重量(g)体积(mL)比(1：5)参加匀浆缓冲液(匀浆缓冲液组成：250mmol/L 蔗糖、10mmol/L Tris-Hcl、5mmol/L EDTA、PH 7.4。)，电动匀浆器匀浆(匀浆 30 s，间隔 30s，反复 3 次)。取 2 mL 匀浆液待用。将剩余匀浆液 800 g 离心 10 min，取上清液；将所得上清 800 g

56、 离心 10 min，取上清液；将所得上清 12000g 离心 15 min，弃上清，所得沉淀参加适量缓冲液充分悬浮后，12 000g 离心 15 min，所得沉淀物即为线粒体83。线粒体别离过程全部在 04进行。将制备的线粒体用悬浮液(30 mmol/L 蔗糖、20 mmol/L Tris-HCl、0.1BSA，pH 值为 7.2)悬浮待用。3.3 测试指标及方法3.3.1 线粒体蛋白质含量的测定(1) 测定原理考马斯亮蓝 G250 测定蛋白含量属于燃料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合变为青色，最大光吸收在 465nm，后者在 595nm。在一定蛋白质浓

57、度范围内01000ug/ml，蛋白质-色素结合物在波长 595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。(2) 测定方法试剂配制a：牛血清白蛋白标准溶液：称取 100mg 牛血清白蛋白，溶于 100ml 蒸馏中，即为 1000ug/ml 的原液。11 b：考马斯亮蓝 G250 蛋白试剂：称取 100mg 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml95%乙醇溶液中，参加 85%的磷酸 100ml，最后蒸馏水定容到 1000ml(此溶液在室温下可放置一个月。取 6 支试管，按下表的数据配制 0100g/ml 牛血清白蛋白溶液各 1ml，见表 3-2。表3-20100g/ml牛血清白蛋

58、白溶液配制表试剂牛血清白蛋白溶液(100g/ml)蒸馏水ml蛋白质浓度ug/ml1 管01.0002 管0.020.98203 管0.040.96404 管0.060.94605 管0.080.92806 管0.100.90100c：准确吸取所配各管溶液 0.1 ml 放入具塞试管中，再参加 5 ml 考马斯亮蓝G250 蛋试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置 2min 后用光径 10mm 比色杯在 595nm 下比色，记录消光值，运用 origin7.5 软件，作出标准曲线。测定样品提取液中蛋白质浓度吸取提取液 0.1ml 放入具塞刻度试管中，参加 5ml 考马斯亮蓝 G250 蛋白试

59、剂，充分混合，放置 2min 后用光径 10mm 比色杯在 595nm 处进行比色，记录消光值，并通过标准曲线计算得每毫升溶液中蛋白质的含量，以蒸馏水作空白样。3.3.2 NADH、DCPIP、细胞色素 C 消光系数的测定分别制作 NADH、 DCPIP 和细胞色素 C 的浓度梯度，在一定波长的光波下，用光径 10mm 的比色杯比色，记录消光值，做出标准曲线，标准曲线的 K值为各物质的消光系数。(1) NADH 消光系数的测定取 6 支试管，按下表的数据配制 0100g/ml NADH 溶液各 1ml。放置 2min后用光径 10mm 的比色杯在 340nm 处进行比色，作出标准曲线，由曲线方

60、程得到 NADH 消光系数。表3-3NADH消光系数的测定试剂1000ug/ml NADHmlC缓冲液(ml)NADH 浓度ug/ml1 管01.0002 管0.020.98203 管0.040.96404 管0.060.94605 管0.080.92806 管0.100.90100(2) DCPIP 消光系数的测定取 6 支试管，按下表的数据配制 0100g/ml DCPIP 溶液各 1ml。放置 2min12 后用 10mm 光径的比色杯在 600nm 处比色,作出标准曲线，由曲线方程得到 DCPIP消光系数。表3-4DCPIP消光系数的测定试剂1000ug/ml DCPIP(ml)C缓冲