核酸的化学-PCR课件

1、核酸化学与聚合酶链反应上海交通大学医学院医学检验系临床分子生物学和生物化学倪培华 第一部分 核酸化学Biochemistry of Nucleic Acid 20世纪40年代明确了遗传的物质基础是DNA: 肺炎球菌 20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构 模型和半保留复制20世纪50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码中心法则操纵子用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质核酸（nucleic acid)脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA) 贮存细胞所有的遗传信息，是物种保持进化和 世代繁衍的物质基础 核糖核酸(ribonucl

2、eic acid，RNA) 参与蛋白合成的有3类：第一节 核酸化学概述信使核糖核酸 (messenger ribonucleic acid,mRNA)转运核糖核酸(transfer ribonucleic acid,tRNA)核糖体核糖核酸 (ribosome ribonucleic acid,rRNA)DNARNA腺嘌呤（A）腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）核苷中的戊糖5碳原子上羟基被磷酸酯化 12常见核苷酸名称14多核苷酸链中核苷酸的排列顺序（碱基） 核酸的一级结构15DNA中各脱氧核苷酸的排列顺序四种脱氧的单核苷酸按照一定的顺序以35

3、磷酸二酯键连接而形成的多核苷酸链 DNA的分子结构（一）DNA的一级结构Watson-Crick 双螺旋结构学说 （double helix structure）（二）DNA的二级结构维持DNA二级结构稳定性的因素碱基对间 氢键碱基的堆积力 范氏引力 疏水键正负电荷作用 18（三）DNA的三级结构DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构一条DNA的长链经过一级结构即形成核小体后,其长度被压缩了7倍二级结构,即形成螺旋管后,DNA长度又被压缩了6倍三级结构,即由螺线管形成超螺线管后,DNA的长度在二级结构的基础上被压缩了40倍在由三级到四级结构,即形成染色单体后,DNA的长度在三级结构的基础上被压缩

4、了5倍（四）DNA的四级结构20Types of RNARNAmRNAncRNANon-coding RNA. Transcribed RNA with a structural, functional or catalytic rolerRNARibosomal RNAParticipate in protein synthesistRNATransfer RNAInterface betweenmRNA & amino acidssnRNASmall nuclear RNAIncl. RNA thatform part of the spliceosomesnoRNASmall nucle

5、olar RNAFound in nucleolus, involved in modificationof rRNAmiRNAMicro RNASmall RNA involvedregulation of expression OtherIncluding large RNAwith roles in chromotin structure andimprintingsiRNASmall interfering RNAActive molecules in RNA interferencestRNASmall temporal RNA.RNA with a role in developm

6、ental timing21mRNA的结构 占细胞中总RNA的% - % 不均一分子 有编码序列与非编码序列端：翻译起始序列;端：翻译终止序列少量的间隔序列无帽无尾 原核生物mRNA的结构24Types of RNARNAmRNAncRNANon-coding RNA. Transcribed RNA with a structural, functional or catalytic rolerRNARibosomal RNAParticipate in protein synthesistRNATransfer RNAInterface betweenmRNA & amino acidss

7、nRNASmall nuclear RNAIncl. RNA thatform part of the spliceosomesnoRNASmall nucleolar RNAFound in nucleolus, involved in modificationof rRNAmiRNAMicro RNASmall RNA involvedregulation of expression OtherIncluding large RNAwith roles in chromotin structure andimprintingsiRNASmall interfering RNAActive

8、molecules in RNA interferencestRNASmall temporal RNA.RNA with a role in developmental timing转录后基因沉默(PTGS)的发现目的：1990年美国人纳波里利用转基因技术将一种催生红色素的CHS基因插入牵牛花中，期望得到更艳丽的花朵The Plant Cell, 2, 279-289, 1990结果：原来开紫花的花色没有加深，花 瓣变成了白色，或杂色27A control: not stainedB: wtC: wt + antisense RNAD: wt + ds RNAMex-3 mRNA detec

9、tion in embryos by in situ hybridization282000年，RNA的研究进展被美国科学杂志评为重大科技突破 2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破” 2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成功之一2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位 293032微RNA（microRNA, miRNA）33Precursor of miRNADicerantisense miRN

10、AmiRNPLin-4抑制mRNA的翻译 The mechanism of miRNA silencing分解 mRNAGrisbok,Pasquinelli.Cell ,106:23-34,2001. 一、核酸的大小 DNA：人单倍体细胞中为2.9109bp RNA：分子较小第三节核酸的理化性质二、核酸的水解1、化学法 低pH 发生磷酸二酯键水解 高pH RNA的磷酸酯键易被水解，DNA则不易被水解2、酶法按底物专一性： 核糖核酸酶（RNase）、脱氧核糖核酸酶（DNase） 按对底物作用方式 核酸外切酶：5 3外切酶、 3 5外切酶 核酸内切酶：多核苷酸内部的磷酸二酯键35核酸外切酶：5

11、3外切酶 3 5外切酶 5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 A-C-T-T-A-A-G-C 536核酸内切酶：多核苷酸内部的磷酸二酯键 5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 5 G-C-T-G-3 5-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-5 3-G-C-T-C 537、变性（denaturation）三、 核酸的变性、复性与杂交38解链曲线（熔解曲线，melting curve ）融解温度melting temperature(Tm) 在DNA热变性时，其A26

12、0的升高达最大值一半时的温度 2、核酸的复性(renaturation)（退火，annealing）变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程 影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度3、杂交（hybridization） 两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交第二部分 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction , PCR)1985年 美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术 1988年 美国PE-

13、cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化 1993年 Kary Mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖 1995年 定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实 PCR技术的诞生与发展43PCR反应原理和反应过程（一）DNA的体外复制的步骤：变性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension） 模板DNA引物4种脱氧核糖核苷酸DNA聚合酶其他（二）PCR基本组成：44DNA体内复制半保留复制（semiconservative replication）45DNA的体外复制靶序列靶序列靶序列靶序列Primer 1Primer

14、 253553533靶序列靶序列Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase30次循环后靶序列扩增的数量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon49

15、PCR扩增过程图示50PCR演示51指数增长期线形增长期平台期循环数 # 理论值 实际值Log 产物DNAPCR过程的实时监测AFTER 1 CYCLE 100%= 2.00 x 90%= 1.90 x 80% = 1.80 x 70% = 1.70 x 逆转录生成cDNA方式 以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物，mRNA3末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列（6 bp)混合物作为引物DNA链中的戊糖在3位碳原子上有-OH基团，在 DNA合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷酸5-p与前一核苷酸的戊糖3-OH以磷酸二酯键相连Sanger法是在反应

16、体系中加入 2, 3 -ddNTP，由于其没有 3-OH 而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止双脱氧链终止法（Sanger法）DNA序列分析 57设计沙眼衣原体引物（Chlamydia trachomatis，CT）确定拟要研究的基因:CT Genbank中找到相应的基因序列 采用引物设计软件进行引物的设计 /确保引物的特异性，将设计好的序列在 www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实第三部分 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR) 荧光定量PCR与常规PCR的区别常规PCR技术 对PCR扩增的终产物进行定性及定量分析荧光定量PCR

17、技术 实时监测PCR扩增反应中每一个循环的产物定量分析60实时荧光定量PCR的特点特异性强灵敏度高可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单 PCR 即每个循环后扩增子增加一倍。然而到了一定时候，原料和酶相对于模板大大减少，PCR 的效率就会降低，直至为0。所以实际的扩增曲线是“S”型的，而不是“J”型理想：J 型，2N 方程实际：S 型不可检测期指数期平台期Real time PCR 同样不能直接测出初始DNA 的分子数,但采用的数据是在PCR中期，比末期定量要准确（更接近理想情况）62常用的荧光定量PCR方法SYBR Green I Taqman水解探针分子信标SYBR

18、Green I结合到双链DNA的小沟部位只有与双链DNA结合后才发荧光SYBR 与dsDNA 结合，并且受到激发的时候，可以发出绿色荧光 SYBR Green I 工作原理未结合的SYBR green ISYBR Green I 工作原理SYBR Green I的特点可以用于不同的模板使用方便，价格相对便宜灵敏度很高与非特异性产物结合融解曲线选择良好的引物和探针并优化反应条件 TaqMan Probes荧光素淬灭剂 与目标序列互补FAMTETJOEHEXTAMRA TaqMan 探针的机理 DNA聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测 TaqMan Prob

19、es工作原理 光能量转移Taq游离的探针荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq发出荧光光另一波长的荧光分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补 淬灭剂 茎(5-7bp) 环（15-30bp）FAM Texas Red 分 子 信 标 工 作 原 理探针与DNA模板杂交光发出荧光荧光基团DNA 模板淬灭剂 茎 环光Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量Threshold104103102定量PCR相对定量 提供一种在不需要知道目的基因具体量时,一 种有效的比较样本间 RNA 或 DNA水平的方法 大多数情况下是比较处理组与未处理组，或者 正常组织与病变细胞或组织的mRN