高级生化试验紫外分光光度法的应用课件

1、紫外分光光度法的应用紫外分光光度法的应用一、物质对光的选择性吸收物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定。人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：400760nm。让白光通过棱镜，能色散出红、橙、黄、绿、蓝、紫等各色光。单色光：单一波长的光复合光：由不同波长的光组合而成的光，如白光。光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定比例混合得到白光， 称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。一、物质对光的选择性吸收物质的颜色由物质与光的相互作用方式物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生。 即物质的颜色是它所吸收光的互补色。无色溶液：透过所有颜色的光有色溶液：透过光的颜色黑色： 吸收所

2、有颜色的光白色： 反射所有颜色的光物质的本色物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生。 完全吸收完全透过吸收黄光光谱示意表观现象示意复合光蓝光无色黑色物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄光光谱示意表观现象示意复合光蓝光无色黑 基于物质吸收紫外或可见光引起分子中价电子跃迁、产生分子吸收光谱与物质组分之间的关系建立起来的分析方法，称为紫外可见分光光度法（UV-vis）。二、紫外-可见分光光度法（1）灵敏度高，可测到10-7g/ml。（2）准确度好，相对误差为1%-5%，满足微量组分测定要求。（3）选择性好，多种组分共存，无需分离直接测定某物质。（4）操作简便、快速、选择性好、

3、仪器设备简单、便宜。（5）应用广泛，无机、有机物均可测定。 基于物质吸收紫外或可见光引起分子中价电子跃迁、产生分子紫外-可见分光光度法的基本原理一、透光率（透光度）和吸收度透光率T定义：T 取值为0.0 % 100.0 %T = 0.0 % ： 光全吸收T = 100.0 % ：光全透过吸光度（吸收度）AT=ItI0100%显然，T，溶液吸收度；T ，溶液吸收度。 即透光率T反映溶液对光吸收程度，通常用1/T反映吸光度。定义：A = lg1T= -lgT = lgI0ItA=-lgT , T=10-AtI0 = It + Ia + Ir吸收光反射光透过光 Ia T与A关系：IrA1/T，T=0

4、，A= ，T=100%，A=0紫外-可见分光光度法的基本原理一、透光率（透光度）和吸收度二、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1760年和1852年研究吸光度与溶液厚度和其浓度的定量关系：朗伯定律：A=k1 L比尔定律：A=k1 CA=k C L 一束平行单色光通过一均匀、非散射的吸光物质溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液温度等保持不变时，该溶液的吸光度A与其浓度C及液层厚度L的乘积成正比。入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。均匀、无散射溶液、固体、气体。吸光度A具有加和性。Aa+b+c= Aa + Ab + Ac 注意!适用范围朗伯-比尔定律:L2L时，A、T

5、 ？ 2AA=-lgT , T=10-A=10-kcL吸光系数浓度液层厚度T2二、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分三、吸光系数1、摩尔吸光系数或Em： 在一定下，c=1mol/L，L=1cm时的吸光度。单位：L/(mol.cm)（1）一定条件下是一个特征常数。（2）在温度和波长等条件一定时，仅与物质本身的性质有关，与待测物浓度c和液层厚度L无关；（3）定性和定量分析依据：同一物质在不同波长时值不同。 不同物质在同一波长时值不同。 max表明了该物质在最大吸收波长max处的最大吸光能力。 4、吸光系数的意义: 2、百分吸光系数 / 比吸光系数 ：3、两者关系:A=k c L

6、k = A /c L 一定下,c=1%(W/V)，L=1cm时的吸光度。单位：100ml/g.cm 1g/100ml三、吸光系数1、摩尔吸光系数或Em：（1）一定条件下是一个1定义：以A为纵坐标， 为横坐标，绘制的A曲线。四、吸收光谱（吸收曲线）2吸收光谱术语： 吸收峰max ,吸收谷min 肩峰sh , 末端吸收 强带： max104，弱带： max0.01mol/L)会使C与A关系偏离定律：粒子相互作用加强，吸光能力改变。溶液对光的折射率显著改变。故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。 例： 铬酸

7、盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH 对测定有重要影响。（一）化学因素朗比耳定律假定所有的吸光质点之间不发生相互作用；该定律适用于稀溶液，溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会（二）光学因素1非单色光的影响：入射光为单色光是应用该定律的重要前提：2杂散光的影响：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。3反射和散色光的影响：散射和反射使T，A，吸收光谱变形。 通常可用空白对比校正消除。4非平行光的影响：使光程，A，吸收光谱变形。（二）光学因素1非单色光的影响：入射光为单色光是应

8、用该定律0.575紫外-可见分光光度计依据朗伯-比尔定律，测定待测液吸光度A的仪器。（选择不同波长单色光、浓度）光源单色器吸收池检测器信号处理及显示分光光度计外观分光光度原理图:0.575紫外-可见分光光度计依据朗伯-比尔定律，测定待测液一、主要部件1.光源：2.单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件钨灯或卤钨灯氢灯或氘灯可见光源 3501000nm紫外光源 200360nm色散元件棱镜光栅对不同波长的光折射率不同衍射和干涉,不同波长的投射方向不同玻璃棱镜:适用于可见区石英棱镜:适用于紫外区高度抛光的玻璃上刻有等宽、等距平行条痕狭缝：进出光狭缝。准直镜：复合光平行光色散后聚集狭缝最佳宽度:减小狭缝

9、宽度而溶液吸光度不变。3.吸收池：比色皿、比色杯，装样品溶液。有玻璃、石英杯两种4.检测器：光电，光电池(硒,硅)，光电管(红,紫)，光电倍增管。5.信号处理显示器：放大较弱的电信号，并在检流计上显示出来。一、主要部件1.光源：2.单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件比色皿：玻璃VS石英杯适用的波长范围不一样 石英的范围更广,波长最小可以到达210nm,可以用在紫外光程,一般测核酸和蛋白都用石英比色皿,基本上测什么试剂都可以,但价格高,一般一个都要在几百块人民币 玻璃的局限性大一些,主要用于可见光程,相对便宜 现在市场上塑料比色皿也在流行起来,但主要还是欧美地区使用的最多,特点是价格便宜,不怕摔

10、,可以一次性试用,省时省力,也更安全,也分不同材质,但波长范围仍然还是比石英比色皿小一些光学玻璃适用透过率：320nm-2500nm 紫外石英适用透过率：190nm-2500nm比色皿：玻璃VS石英杯适用的波长范围不一样 二、分光光度计类型 单波长分光光度计双波长分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计可见光区:可紫外-见光区:721型751，754型760型仪器简单，单色光误差大仪器简单，要求光强度稳定高普遍采用的光路wfz800-S,日本岛津UV-300型特定情况（背景、共存组分干扰）下使用各种分光光度计使用化学教学网视频操作二、分光光度计类型 单波长分光光度计双波长分光光度计单光第四节

11、 分析条件的选择一、 测量条件的选择 1.吸光度的范围：T 20%65%，A0.20.7之间吸收最大的波长为入射光，干扰最小二、显色反应条件的选择 显色反应：将试样组分转变成有较强吸收的有色化合物的反应。显色剂：与被测组分化合生成有色物质的试剂。 1. 显色反应的条件：(1) 定量反应、选择性要好； 干扰少。(2) 灵敏度要高，摩尔吸光系数大。 (3) 有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定。(4) 有色化合物与显色剂的最大吸收波长之差60nm。(5) 显色反应的条件要易于控制。2.测定波长的选择： M 十 R MR（被测物）（显色剂）（有色配合物）第四节 分析条件的选择一、 测量条件的选择

12、1.吸光度的范围三、参比溶液（空白溶液）的选择 用于调节100%T，若选择不适当，对测量读数的影响较大。主要是消除溶液中其他组分对光的吸收等带来的影响。1. 溶剂参比液 当试液、试剂、显色剂均无色时，用溶剂(通常是蒸馏水)作参比液； 3. 试剂参比液 如果显色剂或其他试剂略有吸收，可用不含待测组分的试剂溶液作参比溶液。2. 试样参比液 如果试样中的其他组分也有吸收， 但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液。 4. 平等操作参比液 用不含待测组分的溶液，在相同条件下与待测试样同时进行处理，此为平行操作参比溶液。三、参比溶液（空白溶液）的选择 用于调节100%T，定性与定量分

13、析紫外-可见分光光度法主要用于有机物分析。定性分析：比较吸收光谱特征可以对纯物质进行鉴定及杂质检查；定量分析：利用光吸收定律进行分析 （一）定性鉴别：一、 定性分析 对比法：比较样品化合物的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征；或与文献所载的化合物的标准谱图进行核对。同一物质有相同吸收光谱图，反之不一定是同一物质。定性与定量分析紫外-可见分光光度法主要用于有机物分析。（一）咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准品；下：样品咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准品；下：样品2、对比吸光度（或吸光系数）相同条件下，同一物质吸光度比值是吸光系数的比值。（二）纯度检查 1、杂质检查：有杂质时，吸

14、收光谱变形。2、杂质限量检查：以某一波长吸光度值表示； 以峰谷吸光度比值表示。3、对比吸收光谱的一致性将试样与已知标准样品用同一溶剂配制成相同浓度的溶液，在同一条件下分别扫描吸收光谱，核对其一致性。1、对比吸收光谱特征数据：max、 min、 sh不同基团化合物可能有相同的max值，但max有明显差别；有相同吸光基团同系物，其max、 max值接近 ，但分子量不同，E1%1cm差别大。A1/A2=E1/E22、对比吸光度（或吸光系数）相同条件下，同一物质吸光度比值是例1：阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收峰迁移到312nm，只要检测在312

15、nm处是否有吸收峰，即可判断有无水杨酸。例2：无水乙醇精制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留苯，测定其吸收光谱，乙醇在210 600nm之间无吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以纯无水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在250、254nm处出现吸收峰，则说明有苯残留。例3：如药典规定VB12的E1%max，361nm，1cm =207，上述VB12注射液原标示浓度为0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确稀释20倍，水做参比，用361nm测定的吸光度为0.512，其含量为：1%207=x%0.512 ，x%=0.00247%，浓度=0.00247%20=0.049% 例1：

16、阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在28溶剂对紫外光谱的影响 在测定有机物的紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内，应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收光谱的精细结构。 与标准样品或标准图谱进行对比时，必须用相同的溶剂。所选择的溶剂在所研究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂的吸收不可忽略。溶剂对紫外光谱的影响常用溶剂的波长范围如下： . 溶剂 使用波长范围 溶剂 使用波长范围 甲醇 210 二氯甲烷 235 . 乙醇 215 氯仿 245 . 水 210

17、乙酸乙酯 260 . 96%硫酸 210 苯 280 . 乙醚 215 甲苯 285 . 常用溶剂的波长范围如下： 二、 定量分析 分光光度法被广泛的应用在各个领域，环境、医药、石油等测定无机、有机微量成份。由于操作简单，仪器廉价，一般说是常用的首选方法。（一）单组分的定量分析1、标准曲线（工作曲线）法：配制一系列不同浓度的标准溶液，在同一条件下分别测定吸光度，然后以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制A-C关系曲线。符合朗-伯定律，则得到一条通过原点的直线。根据测得样品吸光度，从标准曲线中求得样品溶液浓度，最后计算含量。原理:根据朗伯-比尔定律，选择合适测A，求出浓度。二、 定量分析 分光光

18、度法被广泛的应用在各个领域，环境、医药2、标准对照法 以该物质吸收光谱图中max为入射光，配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cS，测其AS，再将样品溶液推入光路，测其AX，则试样溶液的浓度cX为：例：VB12含量测定：精确吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀释n倍，使其浓度约为30g/ml，另外配VB12标准液浓度为30g/ml，蒸馏水调零，用361nm测定吸光度A，计算：测定液中VB12含量（g/ml）=（A样品/A标准品）30；注射液中VB12含量（g/ml）=（A样品/A标准品）30 n（稀释倍数）V（取样量,ml）2、标准对照法 以该物质吸收光谱图中max为入射光，（二）多组分的定量分

19、析法 在含有多种组分的溶液中，如果要测定多个组分，可以根据情况的不同，采用不同的方法来进行测定。测量依据吸光度的加和性：(1)(2)(3)（二）多组分的定量分析法 在含有多种组分的溶液中，如果要(1)图计算法-两组分吸收光谱不重叠（互不干扰） a 图中，a,b 组份最大吸收波长max不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。(2) 图计算法-两组分吸收光谱部分重叠a、b两组分的吸收光谱部分重叠，此时1处按单组分测定a组分浓度，b组分此处无干扰。在2处测得混合溶液的总吸光度A2a+b,根据加和性计算cb，假设液层厚度为1cm,则：A2a+b=A2a+A2b=E2a ca+ E2b cb(1)图

20、计算法-两组分吸收光谱不重叠（互不干扰） a 例：四环素和金霉素混合物的测定：四环素在0.25 M NaOH中最大吸收峰为380nm，E1%1cm，max =372.0；在0.1M HCl中最大吸收峰为355nm，E1%1cm，max =303.2 ；两吸收峰都可以做为四环素的测定波长。但与金霉素共存时，因为金霉素在355nm处有吸收（金霉素在0.1N HCl中E1%1cm，max =182.6），只能用380nm测定四环素。混合样品在355nm处测定二者的总吸光度,在380nm处测得四环素的吸光度，则两者的浓度都可以求出。测定方法： (1)测定1%混合物在0.1M HCl溶液的吸光度A335

21、 (2)测定1%混合物在0.25M NaOH溶液的吸光度A380 计算：四环素浓度C1（g%）= AC1，380 / E1%（C1）1cm，380= AC1，380 / 372.0金霉素浓度C2（g%）=AC1+C2335（E1%（C1）1cm，355 C1）E1%（C2）1cm，355 = AC1+C2335（303.2AC1，380372.0）182.6例：四环素和金霉素混合物的测定：四环素在0.25 M Na(3) 图计算法-两组分吸收光谱完全重叠-混合样品测定 (3)图中，a,b 吸收光谱双向重迭，互相干扰，在最大波长处互相吸收。处理方法如下：1. 解线性方程组法过程：(3) 图计算法-两组分吸收光谱完全重叠-混合样品测2. 等吸收双波长法-注：须满足两个基本条件选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大2. 等吸收双波长法-注：须满足两个基本条件使用注意点1.开机前将样品室内的干燥剂取出，仪器自检过程中禁止打开样品室盖。2.测定紫外波长时，需选用石英比色皿。3. 使用的比色皿必须洁净，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无溶剂残留，切勿用手捏透光面，并注意配对使用，比色皿放入样品室时应注意方向相同。量瓶、移液吸管均应校正、洗净后使