DNA重组技术的基本工具课件

1、 课标要求：现代生物科技专题 拓展学生的生物科技视野,增强学生的科技意识,为学生进一步学习生物学类专业奠定基础。 模块解读 课标要求：现代生物科技专题 模块解读现代生物科技专题科学技术现代基因工程克隆技术胚胎工程生态工程基本概念和基本原理技术流程、操作和应用伦理问题生物技术的安全性与伦理问题社会交流、讨论、辩论现代生物科技专题科学现代基因工程基本概念和基本原理技术流程、 课程标准中有关现代生物科技专题的核心知识的要求 细胞工程 课程标准中有关现代生物科技专题的核心知识的要求 细胞工程 本模块知识内容的构建顺序：基因工程 细胞工程 胚胎工程 生态工程 分子水平细胞水平个体水平群体水平微观宏观中观

2、 本模块知识内容的构建顺序：分子水平细胞水平个体专题一 基因工程专题一 基因工程科技探索之路 1944年，艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。科技探索之路 1944年，艾弗里证明DNA是遗传物质科技探索之路 1953年，沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。科技探索之路 1953年，沃森、克里克提出DNA的双螺旋科技探索之路克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制科技探索之路克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆科技探索之路 1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。科技探索之路 1963年

3、尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程 基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。基因工程的概念 基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切 拼接 导入 表达基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取4到5g。1979年，美国将人的胰岛素基因

4、重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药 据WTO调查： 2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？DNA(基因)mRNA 蛋白质(性状)转录翻译每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取4到5g。1979年某种药物蛋白的基因烟草的DNA如何实现药物基因在烟草中的表达，提前要做哪些工作？某种药物蛋白的基因烟草的DNA如何实现药物基因在烟草中的表达准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） 限制性内切酶DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）

5、DNA连接酶基因转移工具（“分子运输车”） 运载体准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）DNA片段的连接工具（ DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具学习目标1、明确基因工程的原理。2、举例说明基因工程的操作工具、种类和作用。3、运用所学的DNA重组技术，模拟制作重组DNA分子模型。学习目标1、明确基因工程的原理。自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？2.单细胞生物并没有在进化中灭绝，有何保护机制？可能产生了一些特殊的酶来防范。可而这种酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。“分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀”自然界是否存

6、在一种生物的DNA进入另一生物的情况？可能2.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?引导学生从噬菌体侵染细菌中获得灵感2.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？1、DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列；2、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使了限制酶不能切开。为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？1、DNA分子不具限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：2.种类与命名：主要从原核生物中分离纯化 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。例如：流感嗜血

7、杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:Hind、Hind和Hind限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：主要从原核生限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：2.种类与命名：3.功能（特异性） 识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化限制性核酸内切酶“分子手术刀” 识别双链DNA分子 T磷酸二酯键1234512345 A T磷酸二酯键1234512345 ADNA重组技术的基本工具课件限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：2.种类与命名：

8、3.功能（特异性）4.限制酶识别序列 识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源： 识别限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：2.种类与命名：3.功能（特异性）4.限制酶识别序列5.作用结果： 识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸

9、组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源： 识别 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。EcoR黏性末端黏性末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核Sma平末端平末端Sma平末端平末端GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG酶切GAATTCGAATTCEcoRGAA“分子缝合

10、针” DNA连接酶 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.“分子缝合针” DNA连接酶 DNA连接 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，EcoT4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效DNA复制思考：“寻根问底二”DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的单链核苷酸片

11、段的末端，形成磷酸二酯键,需要摸板。DNA连接酶是连接两个双链DNA片段的末端，形成磷酸二酯键,不需要摸板。DNA复制思考：“寻根问底二”DNA聚合酶只能将单个核苷酸加比较几种酶的作用断开的化学键结果限制性内切酶DNA酶DNA解旋酶特定位置的磷酸二酯键碱基对之间的氢键脱氧核苷酸DNA片段特定末端DNA单链全部的磷酸二酯键比较几种酶的作用断开的化学键结果限制性内切酶DNA酶DNA解DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链双链单链连接部位在两DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键模板不需要需要DNA连接酶与DNA聚合酶是同一物质吗?聚焦二： “分子缝合针”

12、 - DNA连接酶DNA复制DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链双链单链连接部位在两DN要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。基因进入受体细胞的载体“分子运输车”要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，运载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体： 细菌的质粒 噬菌体的衍生物或某些动植物病毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？霍乱菌

13、的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 运载体需要的条件：假如目的基因导入受体细胞后不能复制或常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点限制性核酸内切酶（分子手术刀)识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端功能来源结果DNA连接酶（分子缝合线)基因进入受体细胞的载体（分子运输车)功能种类种类条件对受体细胞无害。Ecoli连接酶将

14、切下来的DNA片段拼接成新的DNA片段。T4 DNA连接酶能在受体细胞中稳定保存并大量复制。有一个至多个限制酶切割位点。有特殊的遗传标记基因，便于筛选。质粒、动植物病毒和噬菌体的衍生物。总 结限制性核酸内切酶（分子手术刀)识别双链DNA分子中特定核苷 课下制作：使用EcoRI酶、E.coliDNA连接酶形成的DNA重组的模型 ，下节课展示。 课下制作：CTGCAG(1)GCCGGCTTAA GACGTCGCCGGTCAAATTC G (2) (3) (5)(6)(7)(8)CTGCAG GACGTC(1) (5)GTCAACTGACTGGTCA (2) (7)GCCGGCCG(6)(3)（4）

15、GCTTAAAATTC G(8)可缝合两片断，上下左右颠倒颠CTGCA(1)GCG GGCG习题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素对照组实验组1实验组2实验组3 结 论预期一+既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因预期二+只含有抗四环素基因预期三+只含有抗氨苄青霉素基因预期四+既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因习题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨

16、苄青霉素的基因,现探讨质粒的构建与改造1)删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。2)灭活某些质粒的编码基因。3)加入易于识别的选择标记基因。 4)加入特殊的基因表达调控元件。 一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运载体进行人工改建。 质粒的构建与改造 一般来说，天然运载体往往不能满足人类1、关于限制酶的说法中，正确的是（ ）A限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列 BEcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA D限制酶只存在于原核生物中练习1、关于限制酶的说法中，正确的是

17、（ ）练习2、DNA连接酶催化的反应是( )ADNA复制时母链与子链之间形成氢键 B黏性末端碱基之间形成氢键C两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接 DA、B、C都不正确3.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ）A.同种限制酶 B. 两种限制酶C.同种连接酶 D. 两种连接酶Ac2、DNA连接酶催化的反应是( )3.在基因工程中，切3、作为基因的运输工具载体，必须具备的条件及理由是( )A能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选A3、作为基因的运输工具载体，必须具备的条件及理由是( 4.基因工程常用的受体细胞有（ ）（1）大肠杆菌 （2）枯草杆菌（3）支原体 （4）动植物细胞A. （3）（4） B. （1）（2）（4）C. （2）（3）（4） D. （1）（2）（3）B5、在受体细胞