原核表达调控与色氨酸操纵子

1、转录：在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以DNA链的一条链为模板，按照碱基配对原则合成RNA链的过程。不对称转录：在DNA双链分子中，转录通常只在DNA的一条链上进行，另一条链则不能转录，但可能对转录起调节作用，这种转录方式称不对称转录。转录单位：就是从启动子到终止子的一段DNA序列。第一节 转录概述第一页，共五十一页。一、基因的编码链和有意义链 模板链：用于转录RNA的链称为模板链，或负（）链，又称无义链。编码链：与模板链互补的DNA链称为编码链，或正（）链，又称有义链。第二页，共五十一页。二、转录的基本要点 底物：NTP； 模板：反义链；方向：53 ；酶：RNA pol ；产物：RNA单链

2、第三页，共五十一页。转录和复制：都是遗传信息的传递第四页，共五十一页。三、转录起始位点转录起点位点核苷酸为1。上游序列upstream ：转录起点的前面的序列，用负数码（）表示，起点前一个核苷酸为1。下游序列downstream： 转录起点的后面的序列，用正数码（）表示。没有编号为的碱基。第五页，共五十一页。第六页，共五十一页。第二节 原核生物转录的过程 RNA的转录包括promotion，elongation，termination 三过程；从promoter到terminator称为transcriptional unit；原核生物中的转录单位多为 polycistron ；转录起始点记为

3、+1，其上游记为负值，下游记为正值。+1 -10 +10upstreamstart pointdownstream第七页，共五十一页。一、转录的起始 关键：全酶能以很高的亲和性结合在启动子promoter ；启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列。第八页，共五十一页。转录的起始核心酶在因子帮助下特异性结合到DNA上；RNA pol与启动子-35 box 结合，形成封闭型起始复合物；酶滑动到-10 box，转变成为开放型起始复合物，启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初的2个核苷酸；酶继续加上开头的几个NTP，形成三元起始复合物，在RNA链合成了89个碱基后，因子解离，转录

4、开始。 第九页，共五十一页。Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and a promoterDNAIncorporating the first few Nt第十页，共五十一页。二、原核生物转录的延伸 RNA pol沿着模板链移动，RNA链不断延伸，并保持三元复合物的结构；转录泡中的DNA螺旋前开、后合，RNA延长，不断脱离DNA；RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的区域，转录就会减慢/停顿。 第十一页，共五十一页。17bp螺旋解开长度12bpDNA-RNA复合体长度第十二页，共五十一页

5、。影响RNA延伸速度的因素： RNA pol； 暂停信号：导致转录速度突然出现变化的特殊序列。GC富集区：产物RNA不易释放；IR：产物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢复双链。 其他配基：ppNpp、NusA蛋白。第十三页，共五十一页。NusA protein ： 69 Kd, acid protein RNApol-attaching factor Impel RNApol. pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA After initiation substi

6、tuting NusA + core E antitermination N protein utilization substance第十四页，共五十一页。第十五页，共五十一页。三、原核生物转录的终止 转录的终止依赖于RNA产物的特定序列；原核和某些真核生物的终止子要求转录产物RNA 3端具有发夹的二级结构，茎部富有GC序列；终止子的分类： 根据终止反应是否需要蛋白第十六页，共五十一页。1、不依赖于因子的终止子（强终止子）结构特点：RNA具有一个发夹结构（富含GC）和随后polyU片段。 作用机制：RNA pol + 发夹结构 转录暂停 后随杂合分子不稳定的poly(U-dA) RNA容易从

7、模板上脱落RNA-DNA-RNA pol 解聚 转录终止第十七页，共五十一页。第十八页，共五十一页。2、依赖于因子的终止子（弱终止子） 因子：55kD，六聚体。能够利用水解ATP释放的能量使RNA从三元复合物中释放出来；结构：仍然具有茎环结构，但GC碱基对含量较少，下游也缺乏polyU结构。 第十九页，共五十一页。第二十页，共五十一页。第三节 原核生物转录的调控基因表达的调控主要发生在转录水平；转录水平上的调控是最为经济、灵活，又是最为重要、复杂的调控； 确定需要转录基因的起始位点； 精细调节基因表达的水平； cis factor 与 trans factor 严格又灵活的互作； 保证RNA

8、pol的连续转录，准确终止。第二十一页，共五十一页。一、原核转录调控的相关概念 （一）诱导和阻遏：诱导：酶的合成取决于特定物质（常为substrate）的存在。如培养基中乳糖的存在促进了E.coli的半乳糖苷酶的合成；阻遏：当培养基中某种物质（常为product）含量较高，细胞就关闭合成这种物质的能力。如培养基中Trp的存在抑制了E.coli Trp的合成；第二十二页，共五十一页。（二）调控的效应物调节蛋白 + 小分子物质 原核操纵子的诱导/阻遏。这些小分子是基因表达的调节物质-效应物。诱导物（inducer）：与调节蛋白结合，使其从DNA分子上脱落下来，RNA pol开始转录。 辅阻遏物（c

9、o-repressor）：与调节蛋白结合，可以提高调节蛋白与操纵基因的亲和性，进而关闭结构基因的转录。第二十三页，共五十一页。（三）正调控和负调控 正调控：调节蛋白与操纵子结合后促进转录的进行。 负调控：调节蛋白与操纵子结合后抑制转录的进行。正、负调控都存在着诱导和阻遏。第二十四页，共五十一页。二、操纵子理论（operon concept）定义：原核生物基因表达和调控的单元。包括： 结构基因：编码控制某一代谢途径的相关的酶； 调控元件：是调节结构基因转录的一段DNA序列，包括启动子和操纵基因； 调节基因：其产物（调节蛋白）能够识别并结合操纵基因，决定结构基因的转录与否。 主要见于原核生物的转录

10、调控，如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等第二十五页，共五十一页。色氨酸操纵子色氨酸操纵子(Trp operon)是一种重要的操纵子，是联合使用或转录的一组基因，也是用来编码生成色氨酸的元件之一。色氨酸操纵子是在许多细菌存在，但首次在大肠杆菌中得到表征。当在环境中存在足量的色氨酸，它将不被使用。第二十六页，共五十一页。1.大肠杆菌色氨酸操纵子结构较简单，也是研究得最清楚的操纵子，结构基因依次排列为trpEDC2BA，其中trpGD 和trpCF基因融合。2.枯草杆菌色氨酸操纵子的结构有所不同，7 个结构基因中的6 个依次排列为trpEDCFBA，存在于含有12个结构基因的

11、芳香族氨基酸超操纵子（a ro operon），第7 个结构基因，trpG存在于叶酸合成操纵子中，该酶参与Trp 和叶酸的合成。有2个启动子参与调控，一个位于aro operon的起始位置，另一个则位于trpE 上游约200 bp处。第二十七页，共五十一页。RPOLaEDCB A调节基因前导区弱化子间隔区结构基因间隔区调节作用601621560159311961350804第二十八页，共五十一页。Trp的调控作用途径 Trp合成途径较漫长，消耗大量能量和前体物，受到严格调控，其中色氨酸操纵子发挥着关键作用。调控作用主要有三种方式：阻遏作用、弱化作用以及终产物Trp 对合成酶的反馈抑制作用。阻遏

12、作用1.trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白的基因是trpR，该基因距trp operon基因簇很远。它结合于trp 操纵基因特异序列，阻止转录起始。在有高浓度Trp存在时，阻遏蛋白- 色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且与色氨酸操纵子紧密结合，因此可以阻止转录。当Trp 水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，同时Trp 生物合成途径被激活。第二十九页，共五十一页。RPOLaEDCB A高色氨酸时 低色氨酸时 AUG前导肽邻氨基苯甲酸合酶邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶吲哚甘油磷酸合酶色氨酸合酶和亚基mRNAm

13、RNA第三十页，共五十一页。弱化作用 trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用（attenuation）实现的。枯草杆菌色氨酸操纵子表达主要受到色氨酸激活RNA结合蛋白(Trp -activated RNA - binding p rotein,TRAP）的调节。该蛋白与色氨酸结合被激活后，可与trpE上游转录产物结合，导致转录终止。当色氨酸浓度较低时，TRAP失活，转录可以继续，结构基因得以表达。第三十一页，共五十一页。反馈抑制作用由于基因表达必然消耗一定的能源和前体物，相对于阻遏和弱化作用，反馈抑制作用更为经济和高效。终产物Trp对催化分支途径几步反应的酶具有反馈抑制作用，其50%抑制浓度

14、分别为：邻氨基苯甲酸合酶，0. 0015 mmolL - 1 ；邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，0. 15 mmolL - 1 ;色氨酸合成酶,7. 7mmolL - 1。对于普通野生菌株，邻氨基苯甲酸合酶对Trp合成起到关键调控作用，常被称为瓶颈酶；但对高产Trp工程菌而言，上述任何一种酶的反馈抑制都会直接影响Trp产量。第三十二页，共五十一页。The Bacillus subtilis TRAP Protein Can Induce Transcription Termination in the Leader Region of the Tryptophan Biosynthetic (tr

15、p) Operon Independent of the trp Attenuator RNA2014第三十三页，共五十一页。1. In Bacillus subtilis, transcription of the tryptophan biosynthetic operon is regulated by an attenuation mechanism. 2. When intracellular tryptophan levels are high, the TRAP( trp RNA-binding attenuation protein ) protein binds to the

16、 5 leader region of the nascent trp mRNA and induces transcription termination. 3. In limiting tryptophan, TRAP does not bind and the operon is transcribed. Two competing RNA secondary structures termed the antiterminator and terminator (attenuator) can form in the leader region RNA. Research Backgr

17、ound第三十四页，共五十一页。4. In prior attenuation models, the only role of TRAP binding was to alter the RNA secondary structure to allow formation of the attenuator, which has been thought function as an intrinsic transcription terminator. 5. However,recent studies have shown that the attenuator is not an ef

18、fective intrinsic terminator.6.From these studies it was not clear whether TRAP functions independently or requires the presence of the attenuator RNA structure.第三十五页，共五十一页。Figure 1. Model of transcription attenuation of the B. subtilis trp operon.第三十六页，共五十一页。 Research Purposes1. To examine the role

19、 of the attenuator RNA in TRAP-mediated transcription termination, to examine whether TRAP functions independently or requires the presence of the attenuator RNA structure.第三十七页，共五十一页。Material and Methods1.Bacterial strains and transformationsE. coli K802 was used as a host for plasmid construction

20、and propagation. B. subtilis BG2087 (argC4) and BG4233 (argC4 DmtrB) were used as hosts for transformation and integration of gene fusions. BG4233 contains a deletion in mtrB (from codons 762), which encodes TRAP . 第三十八页，共五十一页。 Main content1.TRAP induces efficient transcription termination within th

21、e trp leader region in vivo when the attenuator is mutated.2.TRAP induces efficient transcription termination in vivo within the trp leader region in which the attenuator segment is deleted.3.Mapping the location of TRAP-mediated transcription termination within the mutant trp leader regions.4.TRAP

22、does not cause efficient transcription termination within the mutant trp leader regions in vitro.5.NusA and the timing of TRAP binding to the nascent RNA are important in TRAP-mediated transcription termination.第三十九页，共五十一页。Results1.TRAP induces efficient transcription termination within the trp lead

23、er region in vivo when the attenuator is mutated.A. Diagram depicting the WT and mutant trp attenuators with altered bases in the stem-loop structure or U-stretch. 第四十页，共五十一页。B. Schematic representation of the transcriptional reporter fusions with lacZ that were used to examine TRAP-mediated regulat

24、ion of transcription termination in vivo. 第四十一页，共五十一页。第四十二页，共五十一页。 The results in Table 1 show that TRAP is able to induce transcription termination in the trp leader region despite significant alterations to the stem-loop or to the U-rich tract of the attenuator. But the location where termination

25、occurs in trp leader regions containing altered attenuators will be addressed below.第四十三页，共五十一页。2. TRAP induces efficient transcription termination in vivowithin the trp leader region in which the attenuatorsegment is deleted.Figure 3. Diagram depicting deletion mutations in the stem-loop and U-stre

26、tch of the trp attenuator. stem-loop of the trpattenuator108142第四十四页，共五十一页。第四十五页，共五十一页。3. Mapping the location of TRAP-mediated transcriptiontermination within the mutant trp leader regions.A (A) Schematic diagram of RNase protection assays (RPA) using 32P-labeled antisense probes and cellular RNA f

27、rom B. subtilis.第四十六页，共五十一页。(B) RNase protection assays to determine location of transcription termination in trp leader regions containing mutant attenuators in excess tryptophan.第四十七页，共五十一页。 Together these results demonstrate that transcripts from the trpE-lacZ fusion containing the U-stretch (US)

28、 or the Disrupted stem (DS) mutant attenuator terminate at approximately the same location as transcripts that terminate at the WT attenuator.第四十八页，共五十一页。4. TRAP does not cause efficient transcription termination within the mutant trp leader regions in vitro. (A) Diagram of DNA templates used for in vitro transc