色谱-绪论课件

1、第一章 绪论 第一节 色谱法发展简史一、色谱法的产生 1906 年，俄国植物学家Tsweet （茨维特）在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，玻璃柱中，石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素形成3 种颜色的6 个色带。当时茨维特把这种色带叫做“色谱”，固定相 ，冲洗剂石油醚称为流动相。把茨维特开创的方法称为液一固色谱法( liquid 一solid chromatography ，LSC ) 不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。色谱的“色”字虽已失去原有意义，但色谱名词仍沿用至今。Tsweet 实验色谱柱C

2、aCO3植物色素的石油醚浸取液石油醚（固定相）（流动相）色谱柱固定相CaCO3颗粒流动相石油醚 色带二、色谱法的发展1931 年德国的Kuha 和Lederer 才重复了茨维特的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了-、 -和， - 胡萝卜素，此后用这种方法分离了60 多种此类色素。Martin 和Syng 。在1940 年提出液-液色谱法（liquid 一liquid chromatography , LLC ) ，即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941 年，Martin 和Synge 提出用气体代替液体作流动相的可能性，11 年之后，James 和Martin 提出了从理论到

3、实践较完整的气-液色谱方法（ GLC ) ，从而获得了1952 年的诺贝尔化学奖。在此基础上，1957 年，开创了开管柱气相色谱法，习惯上称为毛细管柱气相色谱法。1956 年，前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965 年，Giddings 总结和发展了前人的理论，为色谱的发展奠定了理论基础。 另一方面早在1944 年，Consden 等发展了纸色谱，1949 年，Macllean 等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板，使薄层色谱法（thin layer chromatography , TLC ）得以实际应用，而在1956 年，Stahl 发明出涂布器之后，才使TLC 得到广泛应

4、用。在20 世纪60 年代末把高压泵和化学键合相用于液相色谱，出现了高效液相色谱法（high performance liquld chromatogra - phy , HPLC ）。20 世纪80 年代初超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography , SFC ) 兴起。而在20 世纪90 年代毛细管区带电泳（ CZE ）得到广泛应用。同时集HPLC 和CZE 优点的毛细管电色谱在20 世纪90 年代后期受到关注。 在药物分析中，对于成分复杂的药品（如中药材、中成药、复方制剂等）分析、杂质检查、痕量分析或含量相差悬殊的成分的分析课题，通常情况下都首选

5、色谱法，在各国药典中都大量收载色谱法，并呈明显上升趋势，是有力的证明。在美国药典中，色谱法在药品质量标准中处于最重要的地位，尤其是HPLC 其应用频率逐版上升，至24 版，HPLC 已成为美国药典应用频率最高的一种分析方法。 高效液相色谱近年来以6 -8 的速度增长，其中较活跃的领域是离子色谱、疏水作用色谱、手性分离及反相色谱。HPLC 除具有GC 的优点外，还具有应用面广，可进行制备分离的特点，多维色谱，如LC -LC -MS 等用于药物、蛋白质、多肽结构测定，并使整个操作完全自动化，这是21 世纪色谱分析的发展方向之一。面对基因工程的挑战，原预计到2005 年，人类3 万-3.5 万条基因

6、测序工作可以做完，现已于2000 年完成，这仍然离不开现代色谱技术的应用。从某种程度上说没有色谱法就没有人类社会发展的今天。二、色谱法的分类 色谱法从不同的角度，有不同的分类方法，通常可按分子聚集状态、操作方法及分离原理等进行分类。（一）按流动相与固定相的状态分类1 按流动相的状态分类：（GC ）、液相色谱（ LC ）和超临界流体色谱（SFC ）。2 按固定相的状态分类:固定相可以是固体或液体。（GSC ），（GLC ) ，（ LSC ），（LLC ) 。（二）按操作形式分类 按操作形式可分为柱色谱法、平面色谱法及逆流分配等类别。柱色谱法（cohimn chromatography ）将固定相

7、装在色谱柱里，色谱过程在色谱柱内进行。按色谱柱粗细，可分为一般柱色谱法、毛细管柱色谱法及微填充柱色谱法等类别。按固定相填充情况，又可分为填充柱色谱法及开口柱色谱法2 类。气相色谱法与高效液相色谱法（HPLC ）及超临界流体色谱法（SFC ）等属于柱色谱法范围。高效液相色谱法与经典液相柱色谱法不同，主要在于色谱柱内填料的性能不同。前者采用高效固定相，而后者用一般固定相。其次是装置不同，前者仪器化，后者手工操作。 平面色谱法（planar chromaiography ）系色谱过程在固定相构成的平面层内进行的色谱法。又分为纸色谱法（paper chromatography , PC ）、薄层色谱法

8、（thin layer chromatography , TLC ）及薄膜色谱法（thin film chromatography , TFC ）等。用滤纸作固定液载体的色谱法称为纸色谱法。将固定相铺在玻璃板或铝箔板上，构成一定厚度的薄层板，用这种薄层板进行分离分析的方法称为薄层色谱法。薄膜色谱法与薄层色谱法类似，主要区别是它的固定相是用高分子材料制成的薄膜。分配色谱法：固定相为液态，利用样品组分在固定相与流动相中的溶解度不同，引起分配系数的差别而分离。LLC 与GLC 都属于分配色谱法范围。流动相的极性大于固定相的极性的液相色谱法，称为反相（reversed phase ,RP ）色谱法；反

9、之，称为正相（normal phase , NP ）色谱法。体积排阻色谱法（size exclusion chromatosraphy , SEC ）也称为凝胶色谱法，是以一定尺寸的多孔固体为固定相，以液体为流动相，按分子尺寸大小进行分离的方法。多用于高聚物分子质量分布和含量的测定。离子交换色谱法（ion exchange chromatography , IEC ）用离子交换树脂为固定相的色谱法称为离子交换色谱法。这种方法是靠样品离子与固定相的可交换基团交换能力（交换系数）的差别而分离。亲和色谱法（affinity chromatography , Ac ）将具有生物活性（如酶、辅酶、抗体等

10、）的配位基键合到非溶性载体或基质表面上形成固定相。利用蛋白质或生物大分子与亲和色谱固定相表面上配位基的亲和力进行分离的色谱法，称为亲和色谱法。这种方法专用于分离与纯化蛋白质等生化样品。毛细管电色谱法（ CEC ）其分离机制是靠色谱与电场2 种作用力，依据样品组分的分配系数及电泳速度差别而分离。该法可分为填充毛细管电色谱法及开管毛细管电色谱法两大类。前者是将细粒径固定相填充在毛细管柱中，后者是把固定相的官能团键合在毛细管内壁表面上而形成的色谱柱。毛细管电色谱法是最新的色谱法，它快速、经济、应用广，是最有前途的分析方法。毛细管电泳法（CE ）样品在毛细管的液体介质中，在电场力作用下的分离分析方法称

11、为毛细管电泳法。它已成为生命科学的最重要的研究手段之一。 第三节 色谱法与其他方法的比较一、色谱法的特点和优点（一）色谱法的特点色谱法是以其高超的分离能力为特点，它的分离效能远远高于其他分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。（二）色谱法的优点1 分离效能高。2 应用范围广。3 分析速度快，一般在几分钟到几十分钟就可完成一次复杂样品的分离和分析。4 样品用量少。5 灵敏度高如气相色谱可以分析几纳克的样品。6 分离和测定一次完成可以和多种波谱分析仪器联用。7 易于自动化分离与分析自动完成。二、色谱法的缺点对所分析对象的鉴别力是较差的，一般来说色谱的定性分析是靠保留值定性，但在一定的色谱条件下，一个保留

12、值可能对应多个化合物。第二章 吸附色谱 第一节 概述色谱法仍是植物成分分离分析的一种重要手段。中草药：有效成分，如生物碱、强心苷、黄酮、皂苷等，此外还含有大量的其他成分，这些成分随药用部位、产地和采收季节的差异而变化。吸附色谱法，是指用吸附剂作固定相，利用被分析组分对吸附剂表面吸附能力的差异和在流动相中溶解度的差异来进行分离分析的方法。吸附剂一般是一些多孔物质，具有较大的比表面积，在其表面有许多吸附中心。吸附剂之所以具有吸附作用，主要就是因为其表面的吸附中心，吸附中心的多少及其吸附能力的强弱直接影响吸附剂的性能。吸附色谱通常采用的吸附剂有：硅胶、氧化铝、聚酰胺和活性炭等。 第二节 吸附剂一、氧

13、化铝 色谱用氧化铝是由氢氧化铝于400 一500 灼烧而成的，因制备方法和处理方法的差别，有碱性、中性和酸性三种，其中中性氧化铝使用最多。碱性氧化铝（pH9-10 ）适用于碱性（如生物碱）和中性化合物的分离。中性氧化铝( pH 7.5 ）适用于分离生物碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸、碱中不稳定的苷类、酯、内酯等化合物。凡是在酸、碱性氧化铝上能分离的化合物，中性氧化铝也都能分离。因此，中性氧化铝的用途极广。色谱前，首先要选择适当活性的氧化铝，若已准备好的氧化铝不符合实验要使之含水量提高以降低活性或加入含水量较低的氧化铝来提高活性。 用氧化铝作吸附剂进行色谱分析时应注意的是：有些化合物如黄酮类、三

14、萜酸能与氧化相结合，有些化合物在氧化铝上会发生一些如异构化、氧化、皂化、水合以及脱水反立这些情况下都不能采用氧化铝作吸附剂。二、硅胶 硅胶通常用SiO2 xH2O 表示，是最常见的吸附剂，约90以上的分离工作都可采用硅胶。 硅胶是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是使硅胶具有吸附力的活性基团，它能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键或发生其他形式的相互作用。被分析物质由于极性和不饱和程度不同，和硅醇基相互作用的程度也不同而得以分离。水能与硅胶表面羟基结合成水合硅醇基而使其失去活性。但将硅胶加热到100 左右，水能可逆地被除去，故将此水称为“自由水”。同氧化铝一样，硅胶的活性与

15、含水量有关（见表），含水量高，活度级数高，吸附力弱。若“自由水”含量达17 以上，则吸附能力极低。若将硅胶在105 -110 加热30min ，则硅胶吸附力增强，这一过程称为“活化”。氧化铝和硅胶含水量与活性的比较硅胶含水量/%活性级氧化铝含水量/%硅胶含水量/%活性级氧化铝含水量/%002510533815156如果将硅胶加热至500 ，由于硅胶结构内的水（结构水）不可逆地失去使硅醇基结构变成硅氧烷结构，从而导致其吸附能力显著下降。失去活性的硅胶含有一定量的水分，可用于分离色素，但其机理是基于分配作用。有时硅胶色谱具有吸附色谱和分配色谱的双重性质，甚至还有极弱的离子交换作用。硅胶具微酸性，适

16、于分离酸性和中性物质，如酚类、醛类、生物碱、氨基酸、甾体及萜类等。硅胶的分离效率与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。硅胶粒度越小，均匀性越好，分离效率越高；硅胶表面积越大，则与样品之间的相互作用越强，即吸附力越强。硅胶的优点在于不像氧化铝那样有时会与样品发生副反应，但硅胶的分离效率有时比氧化铝差，对杂质的吸附能力也弱。与氧化铝类似，不同规格的硅胶都有商品出售，如硅胶G ，表示含有粘合剂锻石膏，此类硅胶用途较广，可以分离许多有机化合物；硅胶CMC ，表示含有粘合剂羧甲基纤维素钠( CMC 一Na ) ；硅胶HF254 ，表示不含粘合剂而含有荧光剂，此外还有硅胶GF254 和硅胶HF254 +

17、365 等。三、聚酰胺聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子物质。色谱常用的是聚己内酰胺，其商品名为锦纶、尼龙-6 、卡普隆等。 色谱用聚酰胺粉是白色多孔的非晶型粉末，不溶于水和一般有机溶剂，易溶于浓矿酸、酚、甲酸。聚酰胺分子内存在着很多酰胺基，可与酚、酸、硝基化合物类等形成氢键，因而产生吸附作用。由于聚酰胺与这些化合物形成氢键的能力不同，吸附能力也就不同，从而使各种化合物得到分离。一般来说，能形成氢键基团较多的物质，吸附能力较强；邻位基团间能形成分子内氢键者吸附力减弱；芳香核具有较多共扼键时，吸附能力增强。聚酰胺可分离极性和非极性物质，如黄酮体、酚类、醒类、有机酸、生物碱、萜类、甾体、苷类、糖类、氨

18、基酸衍生物、核苷类等。尤其是对黄酮体、酚类等物质的分离，远比其他方法优越。聚酰胺薄膜色谱在植物成分分离分析方面应用非常广泛。色谱用聚酰胺薄膜已有商品出售。四、活性炭色谱用活性炭一般分为三类：（ 1 ）粉末状活性炭：该类活性炭颗粒极细，呈粉末状，其比表面积特别大，因此吸附力和吸附量也大，是活性炭中吸附力最强的一类。但由于其颗粒太细，在色谱过程中流速极慢，需加压或减压操作。( 2 ）颗粒状活性炭：颗粒较前者为大，比表面积相对减小，吸附力及吸附量也较前者减弱。但在色谱中流速易于控制，勿需加压或减压操作。( 3 ）锦纶-活性炭：以锦纶为粘合剂，将粉末状活性炭制成颗粒。比表面积介于颗粒状活性炭和粉末状活

19、性炭之间，但其吸附力较二者皆弱。用其分离酸性和碱性氨基酸可取得很好的效果。 活性炭主要用于分离水溶性物质如氨基酸、糖类及某些苷类。活性炭在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中吸附力较弱。在一定条件下，对不同物质的吸附力也不一样。第三节 色谱技术与应用实例 色谱法的形式和机理是多种多样的。前面叙述了各类吸附剂和以这些吸附剂作为固定相进行的色谱法，其机理均基于吸附和解吸作用。为了更好地运用色谱技术，简单地讨论一下吸附色谱过程是必要的。一、色谱过程 以吸附柱色谱法为例，其操作及色谱过程如图所示。把含有A 、B 两组分的样品加到色谱柱的顶端，A、B 均被吸附到固定相上，然后用适当的流动相冲洗。当流动相流

20、过时，如此在色谱柱上不断地发生吸附、解吸、再吸附、再解吸 的过程。若两种物质的理化性质存在着微小的差异，则在吸附剂表面的吸附能力也存在微小的差异，经过反复多次的重复，微小的差异积累起来变成了大的差异，其结果就是吸附能力弱的B 组分先从色谱柱中流出，吸附能力强的A 组分后流出色谱柱，从而使两组分得以分离。ttSBABABAA 1345色谱过程示意图二、吸附平衡吸附过程是样品中各组分分子（X ）与流动相分子（Y ）争夺吸附剂表面活性中心的过程。吸附平衡可表示为：式中：m 代表移动相；n 为配平常数；a 代表吸附剂。吸附平衡常数K 又称为吸附系数，可表示为 :吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动

21、相的性质有关。在吸附色谱中吸附系数不等是组分分离的前提。对于一个混合物的分离，要寻找合适的色谱条件，主要就是选择合适的吸附剂和流动相（展开剂）。三、吸附剂及其选择一个合适的吸附剂，必须同时满足下列要求： 表面积大，内部是多孔的颗粒状或纤维状 的固体物质； 在展开剂中不溶，对展开剂和样品成分不起破坏或分解作用； 在溶液中能吸附样品成分，吸附后又容易用溶剂把样品组分从其表面解吸下来（吸附剂应具有可逆的吸附性）； 最好是白色的固体，以便于观察色谱结果。 在实际工作中选择吸附剂主要是依据样品组分的性质，即它们的溶解度（水溶或脂溶）、酸碱性、极性以及是否与吸附剂发生化学变化等。下面以吸附薄层色谱为例分别

22、加以讨论。1. 组分的溶解度实践证明，不论是水溶性的糖、氨基酸还是脂溶性的脂肪油、挥发油、生物碱、甾类等都可在吸附薄层上分开，所以任何类型的化合物都可首先考虑试用硅胶和氧化铝。水溶性的化合物如果不能得到较好分离时，可试用纤维素或硅藻土（属分配薄层）；脂溶性化合物如果不能得到较好分离时，可试用反相分配薄层。2 组分的酸碱性 硅胶略带酸性，适用于酸性和中性物质的分离；而碱性物质则能与硅胶作用，展开时易被吸附于原点不动或得出拖尾的斑点而导致分离效果很差。反之，氧化铝略带碱性，适用于碱性和中性物质的分离，而酸性物质因与其吸附得较牢而难以得到较好的分离效果。因此，也有把硅胶和氧化铝按近于1 : 1 的量

23、掺和在一起使用，也有在制备硅胶板时加入稀碱溶液或在制备氧化铝板时加入稀酸溶液，或用酸性的或碱性的展开剂展开，以调节各自的酸碱性。3. 组分的极性组分的极性取决于其分子中所含官能团的极性和分子结构，物质的结构不同，其极性也不同，在吸附剂表面的吸附力也不同。通常极性大的物质吸附能力也强。常见化合物的极性（吸附能力）有下列顺序：烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯酮醛硫醇胺酰胺醇酚羧酸。一般而言： 饱和碳氢化合物为非极性化合物，一般不被吸附剂吸附； 不饱和化合物比饱和化合物的吸附力强，双键数多，吸附力增强； 分子中基团的极性越大、极性基团数越多，整个分子极性越大； 分子中取代基的空间排列影响吸附能力，例如:

24、羟基处于能形成分子内氢键的位置时，其吸附能力降低。 由此可见，含双键、三键的烃比饱和烃容易被吸附，含羟基、羧基的化合物比烃和醚容易被吸附，因此有些化合物若含有很容易被吸附的基团，就有可能在硅胶和氧化铝薄层上吸附得太牢而得不到分离。例如： 黄酮（含多个酚羟基）有时就不宜用硅胶和氧化铝，而宜采用聚酰胺作吸附剂。4. 吸附剂对样品的作用碱性氧化铝作吸附剂时，有时会对被吸附的物质产生不良的副反应。例如：引起醛、酮的缩合、酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化等。四、流动相（展开剂）及其选择在柱色谱中称为流动相，在薄层色谱中称为展开剂的，是一种溶剂系统，由单一或混合溶剂组成。以薄层色谱为例，它的

25、作用是在展开后使样品的各个组分在薄层上得到分离。吸附色谱过程实际上是组分的分子与展开剂的分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程，所以展开剂的选择应同时考虑被测物质的性质、吸附剂的活性及展开剂的极性三个因素。分离极性较强的组分，宜选用活性低（级别高）的吸附剂，以极性强的展开剂展开；分离极性较弱的组分时，宜选用活性高（级别低）的吸附剂，以极性较弱的展开剂展开；中等极性组分则采用中间条件进行分离。总之，通过选择吸附剂和展开剂，调整待测组分的Rf 值在0.3 -0.6 为宜。单一溶剂流动相的极性顺序为：石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烷苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸水。以单一溶

26、剂为流动相（展开剂）时，由于溶剂组成简单，因而分离重现性好，但往往难以得到满意的分离，所以，在实际中常采用二元、三元甚至多元溶剂组分。多元混合流动相（展开剂）中不同的溶剂各起不同的作用。一般占比例大的溶剂往往起到溶解待测组分和分离的作用，占比例较小的溶剂则起到调整改善分离物质的Rf 值等作用，有时还需加入少量酸、碱以使某些极性物质的斑点集中，提高分离度。例如：在 环己烷:丙酮:二乙胺:水10 : 5 : 2 : 5 的混合溶剂系统中，水的极性最强，环己烷的极性较弱，它可以降低展开剂的极性，调节Rf 值；丙酮可以混匀整个溶剂系统及降低展开剂的粘度；少量二乙胺的加入可以控制调整展开系统的pH 值，

27、使分离的斑点清晰集中，减少拖尾现象。五、操作方式 吸附色谱法按其操作方式可分为柱色谱法和薄层色谱法。色谱法创始之初（20 世纪）是以柱色谱的形式出现的，30 与40 年代相继出现了薄层色谱与纸色谱。经典的柱色谱法由于样品容量大，主要用于制备分离，而薄层色谱法更适用于分离分析。1 柱色谱法 经典的柱色谱法是将作为固定相的吸附剂装在一根玻管柱中（柱长一般从几十厘米到上百厘米不等），从管顶加入样品溶液，再从管顶加入流动相。使流动相从上往下流过而使各种成分分离并依次流出色谱柱的过程称为洗脱。在洗脱时，可在柱的下端依次收集洗脱液并进行检查，每一份洗脱液从几毫升到几十毫升甚至几百毫升不等。整个分离过程需几

28、小时甚至几天才能完成。经典柱色谱法主要用于分离和精制较大量的样品，通常适用于几十毫克到几十克样品的分离。 近几十年来飞速发展的高效液相色谱法采用远小于经典色谱法的色谱柱（柱长5 -30cm ，柱内径0.2-0.5cm ) ，较细的固定相（粒径5 一10m ) ，用高压泵输送流动相，具有分离性能好、分析速度快、流出组分容易收集、可以在线检测和仪器化等经典色谱法所无法比拟的优点。有关内容将在第三章专门介绍，故此处不再涉及。1.1 色谱柱的选择 色谱柱的装置如图1 -1 所示。其内径与柱长的比例一般在1 : 10 -1 : 20 之间。有时为了获得好的分离效果，可采用细长的色谱柱；有时为了从溶液中吸

29、去某种成分或滤去不溶物以及在利用活性炭脱色时为滤去细微的活性炭颗粒，可采用较矮胖的色谱柱。1 .2 装柱根据所采用吸附剂的不同，装柱方法略有不同：1.2.1 氧化铝 一般先准确量取一定体积的溶剂（vo ) ，将色谱柱的活塞稍打开，将溶剂滴入接受器中，同时将氧化铝慢慢地加入，保持边沉降边添加的状态，直至加完。氧化铝加入速度不宜太快，否则将带入空气泡。必要时可以在色谱管外轻轻敲打振动，使氧化铝均匀下降，并有助于赶走气泡。当采用活性较高的氧化铝进行色谱时，更应注意。待氧化铝加完后，仍使溶剂流动一定时间，然后将氧化铝上面的溶剂全部滴入接受器，准确量取接受器内的溶剂量（V1）。 从V0 一V1 之差，就

30、可以知道氧化铝内包含的溶剂体积。这样在色谱过程中，就可以掌握大致在什么时候开始收集流出组分；当变换溶剂的时候，就可以知道新换溶剂大致在哪一流分开始 氧化铝的用量一般是样品量20 -50 倍， 根据被分离化合物的性质而定。也就是1g样品需要 20 -50g氧化铝进行色谱。氧化铝对萜烯、倍半萜烯等的吸附力较弱，这时氧化铝用量可增至样品量的100 -200 倍，而且为了尽量减少这类化合物在色谱柱中的扩散，色谱过程不能有间歇。1.2.2 硅胶 由于硅胶多为多孔性物质，一般采用湿法装柱，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌待空气泡除去后，连同溶剂一起倾入色谱柱中。最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉

31、降速度不一，硅胶柱将有明显的分段，从而影响分离效果。一般硅胶吸附柱色谱，样品与吸附剂的比例可为1:30 -1:60 较难分离者有时甚至可选1:500 -1:1000 。1.2.3 活性炭 因活性炭在水中的吸附力最强，一般在水中装柱。色谱柱内先加少量蒸馏水，再以玻璃纤维塞住底部，并除去玻璃纤维中的气泡。活性炭以蒸馏水浸泡1h 左右，不断搅拌除去气泡。然后倒入柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。 粉末活性炭因流速太慢，需与硅藻土（1:1）混合后，再用蒸馏水调成糊状装柱。并且待样品上柱后，在色谱管顶端连一有自动控制的加压泵或在色谱管下端连一减压泵进行色谱。1.2.4 聚酰胺 取聚酰胺粉以90-9

32、5乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入色谱柱中。用3-4 倍体积的90-95乙醇洗涤，洗至洗液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣）。再依次用2-2.5 倍体积，质量浓度为5的NaOH 水溶液、1 倍体积的蒸馏水、2-2 . 5 倍体积的10 醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，备用。若用含水溶剂系统洗脱，常以水装柱，方法同活性炭的装柱。若用非极性溶剂系统洗脱时，常以溶剂组分中极性低的组分装柱 若以氯仿装柱，因其比重较大使聚酰胺粉浮在上面，加样时应将柱底端的氯仿层放出并立即加样，加样后顶端用棉花塞紧。在色谱柱关闭时，应将顶端多余的氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层带。1.3 加样 一般将样品溶

33、于有机溶剂中，轻轻注入已准备好的色谱柱上，勿使色谱柱面受到扰动，否则将影响色谱效果。如果样品不易溶于开始色谱使用的有机溶剂，那么先将样品溶于易溶的、易挥发的有机溶剂中，以少量的吸附剂拌匀，然后将有机溶剂挥发干净，再按上述装柱法装柱，将带有样品的吸附剂加在色谱柱中的吸附剂上面。1.4 洗脱 洗脱效果与吸附剂、被吸附物质的性质、温度及溶剂的性质和浓度有关。就溶剂而言，极性溶剂的洗脱能力较非极性溶剂大，所以逐步增加溶剂的极性，可使吸附在吸附剂上的不同化合物洗脱，达到分离目的。 常用混合溶剂作为过渡，开始时逐渐地增加较大极性溶剂的比例（0-10% ) ，以后每次递增（如10 % ) ，然后再更换较大极

34、性的溶剂。1.5 吸附剂的再生 用过的吸附剂经适当方法处理后，可以重复使用。1 . 5 . 1 氧化铝 色谱分离后，除去氧化铝柱上端含聚合物及带有深颜色的氧化铝，用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后，可重复使用。为了使吸附在氧化铝表面的有机物分解，高温活化时间可适当延长。活化后，氧化铝的颜色比使用后的稍淡。一般来说，氧化铝可重复使用多次，重复次数随色谱过程中有机物污染的程度而定。1.5.2 硅胶 由于硅胶对杂质及色素吸附力差，因此回收操作比氧化铝简单。一般可用乙醇或甲醇洗涤，或于索氏提取器中连续抽提除去杂质，洗净的硅胶待溶剂挥发除去后，烘干活化处理即可使用。 硅胶的再生也可用5

35、-10 倍体积，质量浓度为1的氢氧化钠煮沸0.5h，如仍不呈强碱性（以酚酞作指示剂），可追加适量质量浓度为1的氢氧化钠，趁热过滤，以蒸馏水洗3 次，再以36 倍5 盐酸煮沸0.5h ，以蒸馏水洗至中性，120 活化，过筛即得。1.5.3 聚酰胺 用过的聚酰胺粉，一般用5氢氧化钠洗涤，洗到氢氧化钠液颜色极淡为止。有时因某鞣质与聚酰胺有不可逆吸附，用氢氧化钠很难洗脱时，可用质量浓度为5的氢氧化钠在柱中浸泡。每天将柱中的氢氧化钠液放出一次，并加人新的氢氧化钠液浸泡，这样浸泡洗涤一周后，鞣质可基本洗完。然后用蒸馏水洗至pH8-9 ，再以2 倍量10 醋酸洗，最后以蒸馏水洗至中性，即可重复使用。1.5.

36、4 活性炭用过的活性炭可以用酸碱处理回收。因活性炭来源较易，价格便宜，一般不回收使用。2. 薄层色谱法 薄层色谱法是将作为固定相的吸附剂均匀地涂布于平面载板（玻璃板、塑料膜、铝箔）的表面上，展开剂借助毛细管作用流经固定相，使组分分离并保留在固定相上，然后定位、显色。根据斑点的位置，计算Rf 值可以进行定性分析；根据斑点的峰面积（或峰高）可以进行定量分析。薄层色谱法的优点在于：所使用的固定相是一次性的，因此样品的预处理比较简单；被分离物质的性质没有限制，应用范围广；固定相特别是流动相选择范围宽，有利于不同性质化合物的分离；在同一薄层板上可根据被分离化合物的性质选择不同显色剂或检测方法进行定性或定

37、量分析。正因为如此，薄层色谱法自问世以来就受到分析工作者的广泛重视并已发展成为一般实验室必不可少的分离分析方法。薄层色谱的分离分析工作已涉及化学、化工、医药、临床医学、农业、食品工业、毒理学研究等各个领域。H2SO4 1 2 3 4 5 6UV 366 1 2 3 4 5 6 UV 254 1 2 3 4 5 6 1.比移值（retardation factor : Rf )Rf =L/LoRf =0Rf =1Rf =0-1 之间前沿 Lo原点L1 L2实际操作中： Rf =0.2-0.8 为宜最佳范围是: Rf =0.3-0.52.1 制板 薄层板一般分为不含粘合剂的软板及含粘合剂的硬板两种

38、。前者系将吸附剂或载体直接在玻璃板上用干法涂成均匀的薄层，但软板疏松，操作很不方便，目前很少使用。制备含粘合剂的硬板，必须先要制备固定相的匀浆，它是由吸附剂与固定相以一定的比例用水调和而成。由于固定相及粘合剂类型不同，性能也不相同，常用的粘合剂有锻石膏、羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）和某些聚合物如聚丙烯酸等。 薄层所用的玻璃板，除另有规定外，一般为520cm 、1020cm或2020 cm的2mm厚的玻璃板。为了能使吸附剂均匀地涂布，要求板面平整、洁净。然后用手动或自动涂布器将已调制好的固定相均匀地涂铺在玻璃板上。手动涂布器常因推进速度的不同，使厚度不均匀，因此最好采用自动涂布器。铺好的薄层

39、板应先晾干，再在105-110 活化。活化时间为0.5-1h ，冷却后即可使用，也可保存于干燥器中备用。有些薄层板铺好后阴干即可使用，有些薄层板则需要保存在一定湿度下才能获得较好的分离效果，如聚酰胺薄层板。 2.2 点样 溶解样品的溶剂，对点样非常重要。尽量避免用水，因为水溶液斑点容易扩散，且不易挥发。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性溶剂，因为点样后它们能迅速挥发，可减少色斑的扩散。对水溶性样品，采取先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。点样量多少视薄层的性能及显色剂的灵敏度等而定。一般是数微克至几十微克。在检测器灵敏度足够时，应降低点样量，以减少拖尾。 点样的量器为管口平整的点样毛细管

40、或平口的微量注射器。吸取一定量样品溶液，轻轻接触于薄层的点样线上。当溶液稀时，反复点几次，每次点干后再点，溶剂应迅速挥去，否则造成样斑扩散而影响分离效果。原点面积越刁、越好，原点扩散直径以不超过2-3 mm为宜。各点距离为1-2cm 。如在空气中点样以不超过10 min 为宜，以免吸附剂在空气中吸湿而降低活度。2.3 展开根据薄层板的形状、性质选择适当的展开方式。一般来说，软板常选用近水平展开方式，而硬板常选用上行法展开，对于复杂组分的分离常常采用双向展开、多次展开等其他展开方式。多次展开可以采用同一种展开剂，但这样做只是增加了展开距离。另一种方式是为了分离不同极性的组分而采用不同极性的展开系

41、统以达到增加分离度的目的。通常以挥发性大、易除去的溶剂系统为第尸展开系统。此外，还有径向展开、下行法展开等多种展开方式。展开剂的蒸气饱和程度影响样品的色谱行为，尤其在使用混合溶剂时更为突出。在展开过程中极性较弱、沸点较低的溶剂在薄层板边缘容易挥发，致使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，使R ，值相对变大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf 燮哗芝鲤鱼道么连旦那象称塑婪妙返，若在展开前将展开槽与薄层板先用展开剂蒸气饱和，然后再展开，边缘效应即可消除。所谓饱和就是在槽内倒入展开剂，或是在槽的四壁贴滤纸条，使滤纸条浸润展开剂，盖好盖子，待槽内的空间被展开剂的蒸气完全饱和后才进行展开。展开剂的蒸气饱和程度影响样品的色谱行为，尤其在使用混合溶剂时更为突出。在展开过程中极性较弱、沸点较低的溶剂在薄层板边缘容易挥发，致使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，使R ，值相对变大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf 燮哗芝鲤鱼道么连旦那象称塑婪妙返，若在展开前将展开槽与薄层板先用展开剂蒸气饱和，然后再展开，边缘效应即可消除。所谓饱和就是在槽内倒入展开剂，或是在槽的四壁贴滤纸条，使滤纸条浸润展开剂，盖好盖子，待槽内的空间被展开剂的蒸气完全饱和后才进行展开。六、定性与定量分析1 定性分析1 . 1 比移值 比