微生物学实验理论及思考题

1、实验一 显微的使用微生物大小定的方二、基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像们由机 械装置和光学系统两大部分组成物镜的性能最为关键它直接影响着显微镜的 分辨率。其中油镜的放大倍数最大，对微生物学最为重要。微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征也是分类鉴定的依据之一微生物 大小的测定需要在显微镜下借助于特殊的测量工具测微尺包括目镜测微 尺和镜台测微尺。其中镜台测微尺并不直接用来测量细胞大小 ，而是用于校正 目镜测微尺每格的相对长度镜测微尺每小格所代表的实际长度因显微镜的不 同放大倍数而异因此用目镜测微尺测量微生物大小时必须先用镜台测微尺进 行校正以求出该显微镜在一定放大倍

2、数下目镜测微尺每小格所代表的相对长 度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微格数，即可计算出细胞的实际大小两重合线间镜台测微尺格数目镜测微尺每格长度=两重合线间目镜测微尺格数思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作 用？答（1）应先用摖镜纸将镜头摖干净，以防止实验的污染。使用油镜时，应先用 低倍镜再用高倍镜，然后再是油镜，用完之后也要用摖镜纸将油镜摖掉。（2）滴加香柏油（3）作用是增加折射率，即增加了显微镜的分辨率，油的折射率和分辨率成 反比，同时与波长成正比。2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？答显微镜的分辨率指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力最小分辨距离

3、越小分辨率越高最小可分辨率距离2NA 且 NA=n.sin,所以分辨率由物 镜的 NA 值与照明光源的波长两个因素决定，当然还有介质的折射率。3、为什么要换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测 微尺进行校正？答不同放大倍数目镜测微尺每小隔所代表实际长度不一样必须用镜台测微 尺进行重新校正，这样目镜测微尺测量的长度才是目前状态的准备长度。 4、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一微生物 的大小时，其测定的结果是否相同？为什么？答：相同的，不同的放大倍数，目镜测微尺每小格所代表实际长度不一样，必须 重新校正，才能得到目前状态的准确长度。实验二 显微直接计

4、法二、基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定 面积和容积的载玻片上（又称计菌器其优点是直观、快速、操作简单。目前 国内外常用的计菌器有：血细胞计数板 Peteroff-Hauser 计菌器及 Hawksley 计菌器等。利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方 法此法是将单细胞微生物的悬液或孢子悬液注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中在显微镜下进行计数的由于加盖盖玻片之后的血球计数板的 计数室的容积是一定的（ ，万分之一毫升所以可根据在显微镜下观察 到的微生物数目来计算单位体积内的微生物总数目，包括死菌和活菌。六、思考题根据你的体会明用血

5、细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何 尽量减少误差，力求准确？答操作时没有先盖盖玻片再加悬液导致体积不准确避免先盖盖玻片再滴 加悬液细胞：多稀释溶液溶液不均匀避免：滴加溶液前混匀悬液实验三二、基原理微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此 对其质量洗涤和包装方法均有一定的要求玻璃器皿的形状和包装方法要求能 防止污染杂菌为准玻璃器皿的洗涤方法根据实验目的器皿的种类所盛的物 品洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同清洗后的玻璃器皿经包装 后即可进行干热灭菌。干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两（P59火焰烧灼灭菌适用于载 玻片、试管口、玻棒、接种工具和金属用具如

6、镊子等的灭菌。通常所说的干热灭 菌是在电烘箱内利用高温干燥空气使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭 菌的目的 而细内蛋白质固与其身含水有，在菌受时， 当境和细内水量大则蛋质固变越，反之之灭菌相 比，干热灭菌所需温度高160170间长1-2h但干热灭菌温度不能 超过 180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。此法适用于玻 璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品、衣物等不能用 干热灭菌。思考题1、为什么在吸管的包装时要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？答：以免使用时将杀菌吹入其中或不甚将微生物吸出管外。2、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？答物品不要摆的太拥挤

7、以免妨碍空气流通灭菌物品不要直接触电热干燥 箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。干热灭菌的过程中严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故电热干燥 箱具有可以观察的窗口，灭菌的过程中玻璃温度较高，注意避免烫伤。电热干燥箱内温度内的温度未降到 70以前，切勿自行打开箱门，以免骤然 降温导致玻璃器皿炸裂。3、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？答：细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关在菌体受热时环境和细胞 水的含量越大，则蛋白质凝固就越快，反之，含水量越少，凝固就越慢。所以干 热灭菌比湿热灭菌所需要的温度更高，时间更长。实验四二、基原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基

8、础培养基有时又 称为普通培养基配方为肉膏 3g白胨 10g 5g 1000ml， pH 。中牛肉为生物供源、能、磷酸和维生，白胨 主提供氮，而 提供无盐在配制固体培养基时还要加入一定量的琼 脂作凝固剂。琼脂常用浓下 96时溶化一实际用在沸水中或下 面以石棉煮溶化以琼脂焦琼脂时固通常不微物 分利用。任何一种培养基，一经制成就应及时彻底灭菌，以备培养微生物使用，一般 培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌法压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密 闭的加压灭菌锅内通过加热使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽待水蒸气 急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽然后关闭排气阀继续加热此时由于 蒸汽不能逸出，灭菌锅内的压力增加，

9、使沸点增高，得到高 100的温度。导 致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。注意点节 （4）升压、保压和降压：关闭排所阀后，锅内压力开始上升。当压力升到所 需压力（一般培养基和器皿灭菌控制 121 分钟）时，控制热源，维持压力 到所需时间后，停止加热，待压力降至接 ”，打开排气阀排气。注意不能 过急地排气则会由于锅内压力突然下降而造成锅内的培养基由于内外压力不 平衡而冲出烧瓶口或试管口，和使棉塞沾染培养基而发生污染。（5）无菌检查：将灭菌的培养基放入 的温室中培养 2448 小时，经检 查无菌生长，可保存备用。思考题1、培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？答：碳源：提供微生物营养碳素（碳

10、架）氮源：提供微生物生长、繁殖所需氮元素无机盐大量元素细胞内的成分渗透压成分定 PH的激活剂 ； 微量元素：酶的激活剂，特殊分子或结构生长因子一种微生物正常代谢必不可少且不能由简单碳源氮源合成的 有机物，一般需要量很少，在微生物体能的功能主要是辅酶或辅基水：在生命过程中必不可少2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？答：1、当然是注意浓度配比不要搞错2、很多培养基的加料顺序有讲究，否则会有沉淀产生3、有些培养基会有不溶物质，分装前应摇匀4、不要忘了调节 值（一般细菌都需要，酵母可能自然 就行，不 过不一定）5、加热溶解时尽量不要煮沸，会损失营养物质3、培养基配制完后，为什么要及时灭菌？若

11、不能及时灭菌，应如何处理？ 答：培养基里含有丰富的氮源，碳源，微量元素等等。如果不立即灭菌，那么，就会长菌。你可能会认为再灭菌不就可以了？！但是，很多的微生物，特别 是真核微生物在生长的时候会改变溶液的 PH同时灭菌后细胞破碎，带入新的 氨基酸，蛋白等，这些都是试验不稳定的因素。如果不能立刻灭菌，应该在配置 培养基的时候直接称取粉末不加入水溶解可在室温保存如果加入的是液体 的，已经配置好的培养基，应该在 4 度并保存，但时间不宜过长。4、高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降 压？答：在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全是极为重 要的因为空气的膨胀

12、压大于水蒸气的膨胀压所以水蒸气中含有空气时， 在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果骤然快速降压，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压 力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。实验五二、基原理将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称为接 种接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术无论微生物的分 离、培养、纯化或鉴定经及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。 接种的关键是要严格的进行无菌操作如操作不慎引起污染则实验结果就不可 靠。影响下一步工作的进行。微生物的培养特征是指微生物在固体半固体和液体培养基中生长后

13、所表现 出的群体生长特征不同的微生物有其固有的培养特征这些特征可以作为不同 种类微生物的鉴别特征之一并能为识别纯培养是否被污染作为参考了解它们 的培养征、掌握其长规律识别、控制利用微物具有重要值。固体培基又分平板斜面两形式在平板主要察菌落面结构形 态及边状况（如 P75 ）斜面主要察菌苔形态。思考题1、用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要 划一条直线？答用斜面接种微生物是为了能挑去微生物培养的单菌落若划多条线或蛇形容 易形成菌苔，失去斜面的培养意义。2、接种环针)接种前后灼烧的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？ 如何判断烧过的接种环已冷却？答：为了消毒灭菌

14、芽孢等，消灭可能引起污染的一切生物体；若没有冷却的话，接种的微生物也会被灼烧致死，所以一定要冷却；一般用接种环在玻璃器皿的上盖内侧接触一会（大约 5s后用接种环接触 培养基，培养基没有被烫坏，没有冷热物接触而发出滋滋声，就认为已冷却，可 以接种了。3、试述如何在操作中贯彻无菌操作的原则？答在超净工作台中无菌操作或在酒精灯附近操作且接种前后接种环都需要过 火并灼烧成红色。试管口（接种管）开关试管帽前后也需过火，若为平板培养则 倒平板过程前后培养基的开口处都要在火焰中过一下接种完毕后接种环仍需 要过火消毒。在个人操作时尽量挽起衣袖，双手 70%酒精消毒，并戴上手套操 作。实验六二、基原理革兰氏染色

15、将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性由这两类细菌细胞壁的 结构和组成不同决定的兰氏阳性细菌细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组 成、壁厚、类脂质量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径 缩小透性降低从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内经 脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色革兰氏阴性不同由于细胞壁肽聚糖层较 薄，类脂含量高。所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使 结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱用复染剂复染后细胞被染上复染剂的 红色。革兰氏色反应是细重要的别特征，为证染色果的正确性采用 规范的色方法是十重要的2、初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色 水洗。3、

16、媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min，水洗。4、脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加 的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏色结果是否确，乙脱色是革兰染色操的关键环节脱色 不足，性菌被误染阳性菌脱色过度，性菌被染成阴性菌脱色时 一般约 30s。5、复染用番红液复染约 2min，水洗6、镜检干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。 思考题1 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什 么？涂片过程中涂片不宜过厚；初染；媒染；脱色；复染。最关键的环节是乙醇脱色。脱色不足，阴性菌被误染成

17、阳性菌；脱色过度，阳性 菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约 2030s2、你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。答：染色结果正确。3、革兰氏染色时，初染前加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌应分别是什么颜色？答：不加碘液。乙醇的脱色后复染前，革兰氏阳性菌为淡紫色，革兰氏阴性菌为 无色。实验七二、基原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个 细胞取一定量的稀释样液接种到平板上经过培养由每个单细胞生长繁殖而 形成肉眼可见的菌落，即一个菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数， 根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数（平板菌计数法

18、 然操作繁，结果需培养一时间才能取，而且定结果易受种因素 影响，是，由于其大的优是可以获得菌的信，所以广泛用于生 制品检，食品、饮和水等含菌指数或染程度检测）本实验是用源水的平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类 繁多它们对营养和其他生长条件的要求差别很大不可能找到一种培养基在一 种条件下使水中所有的细菌均能生长繁殖因此以一定的培养基平板上生长 出来的菌落计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值目前一般是采用普通肉 膏蛋白胨琼脂培养基。思考题1、要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？答板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单 细胞繁殖而成的现象进行的

19、因此首先将待测样品作一系列稀释稀释度的选择 很重要，以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在 个左右 为最好再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中使其均匀分布于平皿中的培养 基内那么平板的均匀程度也是很重要培养过程中的温湿度控制也很关键经 培养后由单个细胞生长繁殖形成菌落统计菌落数目即可换算出样品中的含 菌数。2、你所测的水源的污秽程度如何？3、试比较平板菌落计数衍和显微镜直接计数法的优缺点及应用。答平板计数能有效地检出活菌但是时间长受到培养基及培养条件等系列因素 的影响，而镜检虽然简单快速，但是检出的是总菌数，包括死活，另外由于其是 选择其中一个区域来计数，存在一定的误差。实验八二、

20、基原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物大小通常比常见细菌大几倍甚至十 几倍大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖有的分裂繁殖本实验通过美蓝 染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料它的氧化型呈蓝色还原型无色用美蓝对酵母 的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力， 能使美蓝有蓝色的氧化型变成无色的还原型因此具有还原能力的酵母活细胞 是无色的而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞呈蓝色或淡蓝色借此即可对酵 母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。思考题1、吕式碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？ 试分析其原因。答式碱性美蓝

21、染液浓度越高，作用时间越长，会导致死细胞越来越多。 （2）染色剂作用时间较慢，随时间的增加，被染的死细胞数目增多。染色 剂逐渐导致菌体细胞脱水随时间增加死亡数目增多随染色时间增加更多 的代谢缓慢的老细胞被染色，从而观察时被当成了死细胞。2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别与一般细菌？答通光学显微镜下首先是酵母菌要比细菌大的多酵母菌具有细胞核而细菌没 有细胞核只有拟核也就是核区如果酵母菌在进行出牙繁殖可以清晰看到从菌 体出的芽有些细菌具有鞭毛，而酵母菌不具有鞭毛。酵母菌呈卵圆形、圆形、圆 柱形或柠蒙形,菌落形态与细菌相似但较大较厚呈乳白色或红色表面湿润、 粘稠。微生物学验考试理论试题班级姓

22、名学号成绩1. 革蓝式染的基本操作步骤？细染色的部位？那一最关键，色过度或不足会出现什么问题 步骤：1制片。取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不宜过厚燥和固定2初染。滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色 倾去染液，水洗至流出水无色；3媒染。先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖 去碘液，水洗至流出水无色；4脱色。将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加 乙醇色（一般 20-30s ）,流出 液无色时立即用水洗去乙醇；5复染。将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色 水洗，吸去残水晾干；6镜检。油镜观察。细胞壁革兰氏染成败的关键是精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴

23、性菌；如脱色时 间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的 影响，难以严格规定。2. 为什么湿灭菌比干式灭菌温度？在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝 固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在。 1g 水 100时，由气态变为液态时可放 2.26kj 的热量这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从 而增加灭菌效力。3. 大肠菌群测定时常采用什么方法，分那几步？该方法与菌落总数测定的原理有何不同？常用多管发酵法，包括初发酵试验、平板分离和复发酵

24、试验三步。不同： 落总数：指在一定条件下（如需氧情况、营养条件 pH培养温度和时间等）每克（每毫升）检 样所生长出来的细菌菌落总数，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长所有细菌，所以它并 不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类。大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该法可以确定大肠 菌群的存在和菌群近似值。4. 高压蒸汽菌开始前为什么要排？举例（ ）说明用的高压菌条件？冷空气的热膨胀系数大，若无菌锅内留有冷空气，当灭菌锅密闭加热时，冷空气受热很快膨胀，使压 力上升，造成灭菌锅内压力与温度不一致，产生假性蒸汽压，锅内温度低于蒸

25、汽压表示的相应的温度，致 使灭菌不能彻底。特别是使用只装有压力表，没有温度表的灭菌锅时，尤应注意。如：0.1MPa, 115 ，30min 0,1MPa,121 ,20min5. 划线培养可分曲线和分段法，述各自适用对象？何确定平上单个菌落是否为纯培养？6. 平板法菌总数测定时主要的注事项有哪些？7. 九管法测肠菌群时，取样品 加入 225ml 生理盐水中，然后分别取 释液， 添加到相稀释度的乳糖胆盐培基中。 37培养 ，产气数管数分别为 2，2经分离、验证 试验发现倍乳糖发酵管（ 10ml 组） 1 管产气，1ml 组有 2 管产气， 组无产气。请报告其大 肠杆菌数1108. 根据下表报告样

26、的菌落总：稀释倍数101010菌落总数平板 1平板 2多不可计多不可计19230528389. 紫外线杀原理？最佳杀菌波长多少？细菌营养体芽孢对紫线的抵抗能力一样吗？紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和 DNA 的交联而抑制 DNA 的复制， 另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O ，再使 氧化成臭氧或使水氧化成过氧化氢，臭氧和过氧 化氢均有杀菌作用。最佳杀菌波长为 右。不一样。芽孢抵抗能力大于细菌营养体10. 常用的平板分离方法有那三种？各有什么优缺点？11. 油镜观察的注意事项？滴加什么油？起什么作用？将高倍镜转离工作位置，在待观察的样品区域滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置，油镜镜头此时 正好浸泡在镜油中。注意： 不可将高倍镜转动经过加有镜油的区域。香柏油，为了增加显微镜的分辨率。12. 简述革兰染色的基本原理？根据所学知识判断沙门氏杆菌乳酸链球是阳性还是阴性菌？P82.沙门氏为阴性，乳酸链球菌为阳性13. 细菌芽胞为什么抵抗不良