无菌举例课件

1、无菌举例虎杖苷注射液无菌检查的方法验证1. 样品：虎杖苷注射液 批号20040305。2. 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号040203；霉菌液体培养基，批号040302； 营养肉汤培养基，批号0403045；营养琼脂培养基，批号040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由中检所所培养基室提供。3. 方法：中国药典2005版无菌检查薄膜过滤法方法验证 4. 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢 菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（9

2、8003），来自中国医学细菌保藏中心。5. 菌液制备： 取经34培养1824小时的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105107约为50100cfu/ml备用。 取经24培养1824小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105约为50100cfu/ml备用。 取经34培养1824小时的生孢梭菌硫已醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至107备用。6. 供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋白胨溶液30 ml溶解后，过滤。7. 活菌计数活菌计

3、数结果见表1。表1 活菌计数（cfu/ml）104稀释105稀释107稀释试验次数121212金黄色葡萄球菌5660枯草芽孢杆菌7779白色念珠菌8670黑曲霉菌8076铜绿假单胞菌4750 薄膜过滤法：取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37培养35d，逐日观察，结果见表1、2、3。表2 虎杖苷注射液无菌检查法验证（直接接种法） 菌株 次数 管数培养基硫乙醇酸盐 霉菌 1 2 3 4 5 (d） 1 2 3

4、4 5金黄色葡萄球菌112- - - - - - - - - - - - - - - - - - -21 2- - - - - - - - - - - - - - - - - - -31 2- - - - - - - - - - - - - - - - - - - 白色念株菌1 1 2 + - + + + + + - + + + +212 + - + + + + + - + + + +312 + - + + + + + - + + + + 枯草杆菌112 - - - - - - - - - - - - - - - - - - -212- - - - - - - - - - - - - - -

5、- - - -312 - - - - - - - - - - - - - - - - - - -黑曲霉112 + - + + + + + - + + + +212 + - + + + + + - + + + +312 + - + + + + + - + + + +铜绿假单胞菌112 + + + + + + + + + +212 + + + + + + + + + +312 + + + + + + + + + +生孢梭菌112 + + + + + + + + + +212 + + + + + + + + + +312 + + + + + + + + + +表3 薄膜过滤法人工污染金黄色葡萄球菌（

6、活菌数58cfu）硫乙醇酸盐液体培养基（100ml/滤器）实验次数培养1d培养2d培养3d培养4d培养5d1（冲洗量500 ml）+2（冲洗量500 ml）+阴性对照（50 ml）-9 结论：根据上述结果，由于采用直接接种法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。方法学验证越来越体现其重要性方法学验证越来越体现其重要性,但是微生物检验的方法学验证在2000版中国药典中仅有一项抑细菌和抑真菌试验，这是远远不够的。如果所检的样品具有明确的抗菌活性,必须采用薄膜过滤法检验时,就没有