蛋白质组学与分析技术第一讲课件

1、蛋白质组学与分析技术任课教师：邱德文 杨秀芬 曾红中国农科院植物保护研究所课程名称：蛋白质组学与分析技术 英文名称：Proteomics and its Analysis Technology 讲课课时： 56 学分：3蛋白质组学与分析技术课程教学大纲教学目的和要求教学对象：中国农科院硕士研究生知识背景：要求选修该课的学生基本掌握有关生物化学、分子生物学、普通生物学等相关农业学科的基本理论及实验方法。目的：通过农业蛋白质应用技术与实践学习掌握蛋白质组学的基本概念和学习了解蛋白质组学的现代分析技术。要求：通过课程的学习要求选修课程的学生熟知和掌握一个以上的蛋白质组学的分

2、析技术及方法，促进蛋白质分析技术在今后研究生科研工作中的运用。课程重点与难点教学方法与教学设备要求：课堂讲解及提问讨论，多媒体教学与黑板书写相结合重点： 讲授蛋白质组学的基本理论所涉及的研究内容（蛋白质分离纯化及制备）及分析技术（蛋白质相互作用、液质联仪及蛋白质结构与功能的分析技术）；难点： 该课程内容多所设及的分析技术面广，有关仪器设备难以普及， 实验费用比较高目前不能安排相关试验课程， 所以有关内容比较抽象。课程内容：蛋白质组学主要讲授内容第一章 蛋白质组学概念一、蛋白质组学概念二、蛋白质组学研究与分析技术特点三、蛋白质组学研究目的和意义四、蛋白质组学研究技术简介五、蛋白质组学与分析技术课

3、参考书第三章 蛋白质电泳分析技术 一、蛋白电泳类型二、2-DE电泳的蛋白样品制备技术三、2-DE电泳技术三、2-DE分离后的蛋白检测四、蛋白质电泳图像分析五、双向凝胶电泳面临的问题 第四章 蛋白质层析分析技术与方法 一、吸附层析（AdsorptionChromatography）二、离子交换层析(Ion Exchange Chromatography，IEC)三、 凝胶过滤层析(gel filtration chromatograpHy)四、亲和层析(affinity chromatograpHy)五、聚焦层析 (focusing chromatography)六、蛋白质的分析制备七、高效液相

4、层析与质谱分析 第六章PCR 技术在蛋白质组学中的应用 一、PCR的发展概况二、PCR技术的基本原理三、PCR的反应动力学四、PCR扩增产物五、PCR循环的主要参数六、PCR相关技术第七章 基因文库与cDNA文库在蛋白质中的应用 一、基因文库二、基因文库的分析方法与技术三、cDNA文库四、cDNA文库的分析方法与技术 第八章 基因芯片技术在蛋白质组学中的应用 一、基因芯片技术及应用二、基因芯片操作流程图三、基因芯片操作实例 第十章 基因敲除和RNA干扰技术在蛋白质组学中应用 一、基因敲除的原理二、基因敲除技术的分析与应用三、RNA干扰原理四、 RNA干扰技术的分析与应用第十一章 蛋白质表达系统

5、的建立及应用 一、各种蛋白质表达系统及其特点二、在大肠杆菌中表达蛋白三、问题探讨四、蛋白质在植物中的表达参考书 1、蛋白质组学导论 美 D. C. 利布莱尔. 科学出版社 2、蛋白质化学与蛋白质组学. 夏其昌，曾嵘. 科学出版社3、蛋白质结构分析：制备、鉴定与微量测定.德RM 坎普. 科学出版社 4、蛋白质与蛋白质组学实验指南（影印版）. 澳R.J. 辛普森5、蛋白质组学 中 钱小红 贺福初. 科学出版社6、蛋白质组学原理 英 特怀曼. 化学工业出版社7、药物研究中的蛋白质组学 美哈马驰 科学出版社8、植物基因组学与蛋白质组学 英 卡利斯 化学工业出版社9、基因组学、蛋白质组学与疫苗 意 格兰

6、迪10、药物蛋白质组学 中 郭葆玉 人民卫生出版社11、基因组研究手册基因组学、蛋白质组学、代谢组学、信息生物学、伦理学和法律问题 加拿大 森森 科学出版社12、蛋白质与蛋白质组学：生命科学新视野2 英 索伦森 科学出版社13、Bayesian Inference for Gene Expression and Proteomics基因表达与蛋白质组学贝氏分析 Marina Vannucci14、蛋白质生物农药 中 邱德文等. 科学出版社考试方式课程论文： 20%，根据所学蛋白质组学的概念和蛋白质组学在农业生产上的应用与蛋白质组学的现代分析技术和研究方法结合个人的科学研究或设想提出一个蛋白质组

7、学分析技术的科学研究技术路线和主要研究内容。平时成绩： 20%（课堂回答及出勤）期末考试（笔试）： 60%第一章 蛋白质组学的概念蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与 基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）：Marc Wilkins 20世纪90年代早期提出的，有“基因组学”（genomics）和蛋白质（protein）组合而成。蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。90年代初期开始实施的人类基因组

8、计划，在经过各国科学家近20年的努力下，已经取得了巨大的成就。完成了人类基因的测序及二十余种模式生物（从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫）基因组全序列的测定工作。基因的表达方式错综复杂，同样的一个基因在不同条件、不同时期可能会起到完全不同的作用。关于这些方面的问题，基因组学是无法回答的。所以，科学家们进一步提出了后基因组计划，蛋白质组（proteome）研究是其中一个很重要的内容。 蛋白质组学是后基因组时代功能基因组学研究的新兴学科和热点领域。目前，蛋白质组学已从早期用双向电泳和凝胶蛋白鉴定进行蛋白质表达谱研究扩展到蛋白质研究的几乎所有方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋白质结构和蛋白质胞内移位等，

9、可以理解为大规模研究蛋白质相关问题的学科。蛋白质的特征蛋白质是生命的物质基础， 没有蛋白质就没有生命。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。蛋白质占人体重量的16%-20%。蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的氨基酸之间通过氨基和羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。蛋白质的二级结构二级结构：蛋白质分子局区域内，多肽链沿一定方向盘绕和折叠的方式，主要为Beta折叠和Alpha螺旋结构蛋白质的三级结构三级结构：蛋白质的二级结构基础上借助各种次级键卷曲折叠成特定的球状分子结构的空间构象。蛋白质组对应于基因组的所有蛋白

10、质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组学（Proteomics）指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学；其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。功能蛋白质组学（functional proteomics）功能蛋白质组： 细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体；将多个亚

11、群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。蛋白质组学强调的是针对蛋白质的一个整体思路，蛋白质组学自其出现起， 就有两种研究策略。一种可称为“穷尽法”或“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组学研究技术，力图查清生物体内一切蛋白质，这种大规模系统性的策略较为符合蛋白质组学的本质。另一种策略是“差异法”（也称为“功能法”）它着重于寻找和筛选任何有意义的因素引起的不同样本之间的差异蛋白质谱，试图揭示细胞对此因素的反应途径、进程与本质，同时获得对某些关键蛋白的认识和功能分析。这种方法更趋向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法， 技术上具有更高的可实现性，是目前蛋白质组学在应

12、用上最具前景的领域。蛋白质组学的研究内容主要有两个方面结构蛋白质组学和功能蛋白质组学；结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析，蛋白质表达模式的研究室蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题；功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用。蛋白质的功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标，目前主要集中在蛋白质组相互作用网络关系的研究，它是要揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深层次了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因的结构与蛋白质的结构和功能的关系。978 Cel

13、l 136, March 6, 2009蛋白质组学与分析技术特点蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基（20/4）,而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、

14、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。 蛋白质组学与分析技术特点内容多：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体比较、基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析、细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、环境反应与调控、物种进化、新型药物靶分子、人体病理介导分子、病原菌毒性成分、植物信号识别、植物诱导抗性、免疫增产激发子、抗虫蛋白晶体、植物病害毒素、植物致病相关蛋白等等。分析技术面广：氨基酸组分、序列测定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪；毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电

15、泳； 蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白质结构与功能；园二色谱；X光衍射；高能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学技术。蛋白质组学与分析技术特点分析技术面广：氨基酸组分、序列测定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪；毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳； 蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白质结构与功能；园二色谱；X光衍射；高能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学技术。蛋白质组学研究的最终目标 阐明生命细胞进行代谢、信号传导和调控网络的组织结构和动力学，并理解这些网络如何在病理中失去功能，又如何通过干预如药物和基因改变它们的功能。几乎所有的生理和病理过程，以及药物和环境因

16、子的作用都依赖于蛋白质，并引起蛋白质的变化。反之，对蛋白质组变化的分析也能提供对上述过程或结果的重要信息。蛋白质组的研究不仅为生命活动规律提供物质基础，探索生命奥秘也为某些疾病发生发展机理的阐明和解决途径提供理论根据。 蛋白质组学研究的意义 随着大量DNA序列数据的不断涌现，人们意识到仅仅靠基因组的序列来试图阐明生命现象是远远不够的。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质结构等问题，必须要依赖于对蛋白质组学的研究来解决。蛋白质组学使我们从综合和总体的角度，在分子水平上来研究和把握生命现象，这对于理解生命现象的本质，对于生命科学的每一个分支都将起到强有力的推动作

17、用。任何一种疾病在表现出可察觉的症状之前，就已经有一些蛋白质发生了变化。因此寻找各种疾病的关键蛋白和标志蛋白，对于疾病的诊断、病理的研究和药物的筛选都具有重要意义。 蛋白质组学前景展望 随着技术和方法的不断创新与发展，蛋白质组学研究将在揭示诸如生长、发育和代谢调控等生命活动规律上有所突破，最终也将成为人类重大疾病机制阐明和诊断、防治中的有力武器。病原体基因组和蛋白质组的研究，将为开发新的抗菌素提供理论依据。在恶性肿瘤方面，它从蛋白质整体的水平上研究恶性肿瘤的发病机制，从而使攻克癌症这一难关成为可能。在农业上，育种也将从现在的通过个别基因的转移改进个别性能，使整体性能达到改善。在新药的开发上，它

18、作为好的指导思想，可以加快药物专一作用靶点的探测速度，增加新药临床试验通过率。目前已有数十种蛋白质芯片系统问世，为蛋白质组学研究提供了强有力的手段。蛋白质组学技术本身在今后数年仍将快速发展，而且会向更高的自动化方向发展。蛋白质组学将推动对农作物抗病虫性、抗逆性、药物分子机制和人类疾病本质的认识，协助解决复杂农作物病虫害、兽医、动植物免疫和人类疾病包括肿瘤的预防、诊断、治疗和农作物病虫害的预侧预报等问题发挥更重要的作用。 1.蛋白质作为人类食物主要营养成分存在于不同的农作物中；2.蛋白质在植物生活中具有不同生物学功能（细胞调亡和细胞器）；3.蛋白质作为酶在植物生长代谢中起作重要的作用；4.蛋白质

19、作为生物信号传导的受体对外界信号在植物生活中进行传导；5.植物中某些蛋白具有抗病虫的生物功能；6.蛋白质及多肽能诱导植物抗逆性，促进植物生长和提高作物品质；蛋白质组学与农业的科学实践蛋白质组学研究技术 蛋白质组研究中的样品制备 蛋白质组研究中的样品分离和分析 ：双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质区分开来是一种很有效的手段 ；质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。 蛋白质组研究的新技术 做过双向凝胶电泳的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前，二维色谱

20、 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色谱毛细管电泳 (LC-CE) 等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用 (CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。随着对大规模蛋白质相互作用研究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也被科学家所关注。此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。 蛋白质组生物信息学 生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、R

21、ockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。 蛋白质组学发展趋势 近年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型

22、药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。研究蛋白质相互作用的技术平台酵母双杂交系统的发展和应用 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

23、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）蛋白质组、蛋白质组学及研究技术路线 蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。 翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。 蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶

24、底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。 对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。 蛋白质组学研究与科学论文蛋白质的提取、分离、纯化、功能鉴定到获得该蛋白的基因克隆（完成硕士论文）已知蛋白质克隆、纯化表达与功能验证及相关机理研究（

25、Sci因子在2-3之间）新蛋白、新功能、新基因蛋白质结构与功能研究、功能验证与作用机理（SCi因子3-5）。蛋白质受体、信号传导、蛋白质相互作用及受体鉴定及功能验证和分子机理（Sci因子6-10）。Pred: CCCHHCCCEEEECCCCCCCCCCCCCHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC AA: MSAVVSKNLFALLGNDEEDDTPKAPVKTVDKKVTHTTKRTGADEAPRSNAAAAGSRRGAGPred: CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCHHHHHHCCC AA:

26、 NDGGDRRPRNTDEARGPRGGIGARARGGRGGSFRRDRDDRHAKNLPSGGSEKTAAQSWGAPred: CCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHC AA: TEGEAELKDEQAGEELAKKEQKEANAEDAAAEEPVEEEDKSISYADYLAQQAEKKLALDNPred: CCCEEECCCCCCCCHHHCCCCCCCCCCCHHHHHHCCCCCHHHHHHEEEEEEEECHHHCCC AA: DLKVRQANEGTKLKKEWAAAKPLVKDEDDDFIAGSGG

27、KAKRERERKVKQVVDIDQRFVEQPred: CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCE AA: QDRPRGGGRGGPRGGARGEFRGGRGRGEGRGRGDFGGRGRGGPRDGPREGGRGGPRGGAQPred: EECCCCCEEECCCHHHHHHHHCCCCCEEEECCCCC AA: TINTKGHVCVPLPWQQLEAVFATNPTLTMQRDTIQ 富G(52 15.5%), 少C(1 0.3%)巻曲较多，与热稳定有直接关系。二级结构预测 Activator 1 MLIYKD

28、IL TGDEIISDSY NLQEIDGVVY EADCTKINV- GGESFDTGAN Activator 48 ASAEEQEEGA EDNVETKIDV VYSFRLNETG FDKKGYLTYL KGYMKAVKEA Activator 98 LKSKGADEAT IKDFETKASG YAKKIISNFK DYEFFTGESM NPDGMIVLLN Activator 148 YREDGVTPYV TVWKHGLEEM KV TCTP1TCTP2TCTP1：暴露在蛋白的表面，亲水性强，结构无固定规则-为可能的活性位点TCTP2：无规则卷曲，固定在在两个折叠之间结构与功能研究酵母双杂交的基本原理 酵母双