生理实验2课件

1、实验二 反射弧分析、刺激强度和刺激频率与肌肉收缩反应的关系，神经干动作电位和神经传导速度的测定反射弧模式图反射弧分析基础知识定义 反射是指在中枢神经系统参与下，机体对内， 外环境变化所作出的规律性应答。基本结构 反射的结构基础和基本单位是反射弧 感受器 传入神经 反射弧 神经中枢 传出神经 效应器实验目的 通过制备脊蟾蜍的方法，引导出单纯的脊髓反射，观察这些反射，证实反射弧的完整性与反射活动的关系。步骤和方法制备脊蟾蜍标本，分离右侧坐骨神经。（探针捣毁脑部不要捣毁脊髓或采用断头法制备）分离右侧大腿坐骨神经干，并穿线备用肌夹夹住下颌，悬挂在铁支架上。注意事项毁脑时不可伤及脊髓，以免破坏脊髓反射中

2、枢。分离坐骨神经应尽量向上，并尽量剪断与其相连的分支。每次酸刺激后应立即用清水洗净脚趾，并用纱布揩干。剥脱脚趾皮肤要完全，若剩留少量皮肤会影响实验结果。思考题反射弧有哪几部分组成，各部分具有什么作用？ 刺激强度和刺激频率与肌肉收缩反应的关系，神经干动作电位和神经传导速度的测定 图5-4 蛙胫骨肌肉背面观1-腓肠肌、2-腓骨肌肉（Peroneus ）图5-5 蛙胫骨肌肉腹面观1-腓肠肌、2-胫骨深肌（Tibialis posticus）3-Extensor cruris、4-Tibialis anticus longus 5-胫腓骨阈刺激阈下刺激阈上刺激有效刺激1.刺激强度与肌肉收缩反应的关系阈

3、强度(threshold stimulus)能引起组织发生反应的最小刺激强度，又称为阈值。具有阈强度的刺激称为阈刺激（threshold stimulus）。一条骨骼肌纤维“全或无” (all-or-none)达到阈值 肌纤维收缩超过阈值 收缩力不增加一块骨骼肌一定范围内，肌肉收缩力的大小与刺激强度成正比阈下刺激 无肌肉兴奋收缩刺激强度最适强度最适强度 收缩力不增加刺激强度达到一定的数值少数兴奋性最高的肌纤维产生收缩肌纤维被兴奋数肌肉收缩力所有的肌纤维均兴奋肌肉收缩反应最大由许多骨骼肌纤维组成的不同的肌纤维兴奋性不同强直收缩(tetanus)骨骼肌受较高频率连续刺激,新收缩过程与上次尚未结束的

4、收缩过程发生总和不完全强直收缩(incomplete tetanus)总和过程发生于前一次收缩过程的舒张期完全强直收缩(complete tetanus)总和过程发生于前一次收缩过程的收缩期在生理条件下,支配骨骼肌的传出神经总是发出连续的冲动,所以骨骼肌的收缩都是强直收缩;静息状态下,中枢神经也经常发放低频率神经冲动至骨骼肌,产生一定程度的强直收缩,称为肌紧张(muscle tone) 1933年美国科学家 Gasser和 Erlanger用示波器对外周神经活动进行研究性总结，并发表了著名的论文Electric signals of Nervous Activity（1939年）。用示波器做蛙

5、坐骨神骨干动作电位实验阴极射线示波器，1922年美国人发明。细胞外记录（ Extracellular Recording）实验阶段 剑桥大学Hodgkin和Huxley应用金属微电极 对乌贼巨神经纤维电活动进行系统研究， Hodgkin和 Katz提出离子假说。 1949年，凌宁和Gerard 发明玻璃微电极。电压钳和膜片钳将电生理研究推向分子水平。用玻璃微电极做细胞电生理实验尖端直径0.5m的玻璃微电极细胞内记录（ intracellular Recording）实验阶段动作电位（Action potential, AP）概念：是指可兴奋细胞受到刺激时，在静息电位基础上产生快速的可传播的一过

6、性电位波动。 单相动作电位(Monophasic Action Potential)损伤区兴奋区细胞外引导电极检流计双相动作电位( Biphasic Action Potential)兴奋区细胞外引导电极检流计（引导电极距离小于动作电位波长） 动作电位的传导 Conduction of AP 动作电位以局部电流的形式传导 局部电流利用朗飞氏结的跳跃传导朗飞氏结动作电位传导速度的测定 (Measurement of Conduction Velocity of AP)+St传导速度测定=SACt刺激器输入通道R1- Rr1+ R2- R2+刺激伪迹(Stimulus artifact)刺激伪迹A

7、P刺激器放大器+地刺激电流i-i+R+R-地刺激伪迹是刺激电流通过导电介质扩散至两引导电极而形成的电位差信号。影响神经纤维兴奋性的因素(Factors Affecting Nerve Fibers Excitability)神经纤维的直径有无髓鞘物种温度药物（如普鲁卡因）、离子（K）等的影响 目的（objective）1掌握蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本的制备方法2观察不同刺激强度和频率刺激对肌肉收缩的影响3.测定蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（compound action potential,CAP） ，研究蟾蜍坐骨神经干的特性、双相动作电位形成机制及神经损伤对神经兴奋传导的影响以及神经干动作电位的传

8、导速度的测定。实验难点实验重点实验重点1.材料和方法 (Materials and methods )1.1实验动物（laboratory animal) 蟾蜍（中华蟾蜍指名亚种，Zhuoshan Toad） 雄性蟾蜍皮肤光滑，前肢趾上有黑色婚垫，会鸣叫。雌性蟾蜍皮肤粗糙，无婚垫，不会鸣叫。1.材料和方法 (Materials and methods )1.2药品(drug) 任氏液任氏液由无机盐和蒸馏水配置而成，每升溶液含NaCl 6.5g、KCl 0.14g、CaCl2 0.12g,、NaHCO3 0.20g、NaH2PO4 0.01g。任氏液的理化特性与蛙的组织液近似。可用于蛙的组织、器

9、官润湿和营养。1. 3器材( Experimental apparatus)BL420 E+/BL420 F生物机能实验系统BL420E+生物机能实验系统可以同时采集、放大、显示、记录、分析四路生物信号及一路刺激输出，12导联心电图输入记录，可用于人体和动物实验。仪器参数全程控设置，有多种数据分析功能和数据转换输出功能。 神经干标本盒。 S+ S- E R1 - R1+ R2- R2+S+、S-刺激电极，E接地电极，r1- 、r1+和r2- 、r2+引导电极，蛙类手术器材一套（蛙板、蛙钉、粗剪刀、手术剪、镊子、刺蛙针、玻璃分针；锌铜弓；滴管、培养皿、500ml烧杯）张力传感器1.4制备坐骨神经

10、干（ preparation of sciatic nerve trunk ） 蟾蜍毁脑脊髓，去上肢和内脏，下肢剥皮浸于任氏液中。 蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；标本腹面向上，用玻璃分针分离脊柱两侧神经丛，用线在近脊柱处结扎，剪断神经；将神经干从腹面移向背面。标本背面向上固定，从大腿至跟腱分离坐骨神经。坐骨神经标本置任氏液中备用。正确持握找到枕骨大孔刺入捣毁脑及脊髓 (观察反应)剪除上肢及内脏剥皮 (剪去肛周一圈)任氏液 5 min; 洗手腹侧朝上 穿线/结扎/剪断/轻提剪分支背侧朝上 肌间勾出游离至膝搭 刮 剪(可在后一步做)跟腱扎 剪制备坐骨神经干（ preparation of

11、sciatic nerve trunk ）关键：游离坐骨神经取一条腿放于蛙板上。将标本背侧向上放置，剪断梨状肌及其附近的结缔组织，沿坐骨神经沟(股二头肌及半膜肌之间的裂缝处)，找出坐骨神经之大腿部分，用玻璃针小心剥离，在神经完全暴露后，用粗剪刀剪下与神经相连的从脊柱，用镊子提起小块脊柱，用手术剪剪断坐骨神经的所有分支，并将神经一直游离至膝关节处。坐骨神经腓肠肌制作坐骨神经小腿标本 制作坐骨神经腓肠肌标本将游离干净的坐骨神经搭于腓肠肌上，在膝关节周围剪掉全部大腿肌肉并用粗剪刀将股骨刮干净，后在股骨中部剪去上段股骨，保留的部分为坐骨神经小腿标本。在跟腱处穿线结扎后剪断跟腱。游离腓肠肌至膝关节处，然

12、后沿膝关节将小腿其余部分全部剪掉，制得个具有附着在股骨上的腓肠肌并带有支配腓肠肌的坐骨神经的标本。残留股骨坐骨神经脊柱片用锌铜弓检查标本腓肠肌肌腱上的结扎线与张力换能器另一端相连张力换能器一端与BL420生物机能实验系统相连接坐骨神经腓肠肌标本的股骨头固定在肌槽的股骨固定孔内earth刺激电极记录电极1.5 仪器连接标本的放置与固定1.6 记录动作电位( Record action potential) 神经干标本置于标本盒的电极上，神经与电极接触良好，调节刺激电压，记录动作电位。神经干标本肌肉神经实验项目设置刺激强度与反应关系实验参数子菜单设置刺激频率与反应关系实验参数子菜单观察刺激强度与收

13、缩反应的关系 观察刺激频率与收缩波形的关系实验项目菜单项2.1刺激强度与肌肉收缩反应的关系2.2 刺激频率与收缩反应的关系2. 观察（observations)连接实验装置：实验项目模块选择 刺激器参数设置：波宽.ms 刺激强度从零开始渐增； 刺激频率改变可从1Hz渐增为25Hz。实验观察： 单收缩的分析 复合收缩实验注意事项： 1实验过程中要经常用任氏液湿润标本，每次刺激后应使肌肉休息30秒，连续刺激不可超过10秒。 2不要用手握住或接触神经。2.3 测定中枢端引导的双相动作电位（biphasic action potential, BAP) 用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神

14、经干末梢端，测定中枢端BAP正、负向振幅(amplitude，A)和时程(duration，D） + - R1-R1 +R2-R2 +中枢端引导的动作电位Central endPeripheral endAc1Dc1Ac2Dc22.4 测定末梢端引导的双相动作电位 用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定末梢端BAP正、负相振幅和时程。Dp1Dp2Ap1Ap2Ap1Ap2+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2.5兴奋传导速度的测定 用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定第1和第2对引导电极引导C

15、AP起点的时间差t ，根据 S R1- R2- / t 计算出AP的传导速度。S R1- R2- t=S R1- R2-t+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2.6 观察刺激强度（U）与动作电位振幅的关系 刺激波宽0.1ms，刺激电压从0.1V开始， 按步长0.05V增加，刺激电压每增加一次刺激神经干一次，并记录刺激电压和MAP振幅。 图 刺激强度与动作电位振幅的关系A（mV)U(V)Maximal stimulusThreshold stimulus要求：测定阈强度和最大刺激强度，刺激强度与动作电位振幅的关系曲线神经干引导所获得复合动作电位（

16、 compound action potential (CAP）与单神经纤维引导的动作电位的性质有所不同。AmDm条件：刺激电压1V, 刺激波宽0.1ms2.7 测定单相动作电位（monophasic action potential，MAP） 用镊子夹伤对1对引导电极间的神经干，然后用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定末梢端MAP振幅和时程。+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2. 观察项目（observations)2.1 刺激强度与肌肉收缩反应的关系2.2 刺激频率与收缩反应的关系2.3 测定中枢端引导的双相动

17、作电位（biphasic action potential, BAP)。用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干末梢端，观察中枢端BAP正、负向振幅(amplitude，A)和时程(duration，D） 2.4 测定末梢端引导的双相动作电位。用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定末梢端BAP正、负相振幅和时程。2.5 兴奋传导速度的测定。用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定第1和第2对引导电极引导CAP起点的时间差t ，根据 S R1- R2- / t 计算出AP的传导速度。2.6 观察刺激强度（U）与动作电位振幅的关系 刺激

18、波宽0.1ms，刺激电压从0.1V开始， 按步长0.05V增加，刺激电压每增加一次刺激神经干一次，并记录刺激电压和MAP振幅。2.7 测定单相动作电位（monophasic action potential，MAP）。用镊子夹伤对1对引导电极间的神经干，然后用1.2V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定末梢端MAP振幅和时程。3.1 刺激强度与肌肉收缩反应的关系阈强度阈刺激阈上刺激最适强度分析阈强度和最适刺激强度？3.结果 （results）3.2 刺激频率与收缩反应的关系单收缩不完全强直收缩完全强直收缩骨骼肌单收缩分析分析三个时期？临界融合刺激频率？3.3 刺激波宽？时，阈

19、刺激Uth为？；最大刺激Umaxs V，刺激电压1.0V时，动作电位的传导速度为 s （m/s)见表1。nUth (v)Umax (V) (m/s)123xs表1 蟾蜍坐骨神经干阈刺激、最大刺激和传导速度3.4 刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms时，中枢端引导的动作电位正相和负相振幅分别为Ac1s mV和Ac2s mV; 末梢端引导的动作电位正相振幅Ap1s mV大于负相振幅Ap2s mV， 两者有（或无）显著性差异（p0.05)；见图1。 3.5 用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定第1和第2对引导电极引导CAP起点的时间差t ，根据 S R1- R2- / t

20、 计算出AP的传导速度。3.6 刺激电压1.0V时，单相动作电位振幅Ams mV大（小)于双相动作电位正相振幅Ap1s mV，两者有（或无）显著性差异（p0.05)；单相动作时程Dms ms显著长于双相动作电位正相Dp1s ms，两者有（或无）显著性差异（p0.05)，见图1、图2。Ap1Ap2Dp1Dp1t图1 蟾蜍坐骨神经干双相动作电位图2 蟾蜍坐骨神经干单相动作电位AmDm3.7在刺激电压低于Uthreshold时，测不到动作电位；刺激电压从Uthreshold增加至Umaximal，动作电位振幅呈曲线增长，刺激电压高于Umaximal动作电位振幅不再增长，见图3。A（mV)图3 刺激强

21、度与动作电位振幅的关系U(V)0.51.01.52464. 讨论(discussion)4.4 在两引导电极间夹伤神经，神经冲动传导被阻断，双相动作电位负相波消失，形成一相正波，于此可见，双相动作电位是神经冲动先后通过两个引导电极形成的，冲动通过第1个电极，形成动作电位的正相波，冲动通过第2个电极，形成动作电位的负相波。4.1 刺激电压从Uth增加至Umax，神经干动作电位振幅随刺激电压增加而增高。神经干动作电位不具有“全或无”性质。坐骨神经干为不同类型的神经纤维组成，各个类型纤维的兴奋性水平不同1，在一个有限的范围内神经干动作电位的大小与刺激的强度成比例2 。4.2 蛙神经冲动的传导速度在20时约为每秒30米 3 ，本实验所测得的蟾蜍坐骨神经干动作电位的传导速度为.4.3 刺激蟾蜍坐骨神经干中枢端，可在其末梢端引导出动作电位，反之也然，由此可以证明离体蟾蜍坐骨神经具有双向传导兴奋的能力。4.5 刺激神经干中枢端在其末梢端引导所得BAP和刺激神经干末梢端在其中枢端引导所得BAP，正相振幅均大于等于负相振幅，正相时程均小于负相时程，由此表明在蟾蜍坐骨神经干AP引导时，两引导电极处神经纤维的多寡不是形成BAP正相振幅大于负相振幅和正相时程小于负相时程的主要原