细胞生物第二章研究方法课件

1、 准备 观察 提出理论 设计实验 收集数据 解释结果 提出结论 参考文献知识 第二章 细胞生物学研究方法一.显微成像技术二.细胞工程技术三.细胞组分的分离技术四.细胞组分的分析方法内容提要一、光学显微镜分辨力 (resolution) 是指能够区别开的两个质点的最小距离。分辨力的最终限度是决定于光的波长。对任何显微镜而言，最重要的是分辨力，而不是放大倍数。分辨率(resolution，R)：R=0.61/(nsin/2)R=0.61x0.5/1.5=0.2mInterference between light waves. When two light waves combine in pha

2、se, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. m (micrometer) = 10-6 m nm (nanometer) = 10-9 m (ngstrm unit) = 10-10 m a.普

3、通光学显微镜取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察b. 荧光显微镜Fluorescent dyes. c.激光共聚焦扫描显微镜Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. d.相差显微镜Two ways to ob

4、tain contrast in light microscopyFour types of light microscopy. (A) The image of a fibroblast（成纤维细胞） in culture obtained by common light microscopy (B) phase-contrast microscopy, (C) differential-interference-contrast microscopy(微分干涉差显微镜 ), and (D) dark-field microscopy.E. Electronic image processi

5、ngLimit of resolution of the electron microscope. Electron micrograph of a thin layer of gold showing the individual files of atoms in the crystal as bright spots. The distance between adjacent files of gold atoms is about 0.2 nm (2 ).二、 电子显微镜光镜与电镜的基本区别类型分辨力光源透镜真空光镜200 n m可见光波长300-700 n m玻璃透镜不要求100

6、n m紫外光波长200 n m玻璃透镜电镜0.1n m电子束波长0.01-0.9 n m电磁透镜要求电镜种类1.透射电子显微镜2.扫描电子显微镜Immunogold electron microscopy. 1.超薄切片（4050nm）。2.固定包埋 切片 染色等过程要求高。3.重金属盐染色或喷镀，以形成不同程度的 反差，提高分辨力。4.负染技术5.冰冻断裂和冰冻蚀刻技术电镜技术的基本要求：Specimen Preparation for Electron MicroscopyChemical fixation Diagram of the copper grid used to suppor

7、t the thin sections of a specimen in the transmission electron microscope. Electron micrographs of individual myosin protein moleculesMetal Shadowing Allows Surface Features to Be ExaminedElectron micrograph of negatively stained actin filaments. 电子显微镜照相冷冻断裂一个植物细胞叶绿体 的类囊体膜Freeze-Fracture and Freeze-

8、Etch Electron Microscopy Regular array of protein filaments in an insect muscle. Scanning electron microscope (SEM) Images of surfaces can be obtained by SEM;Critical-point drying;Range: 15150,000 X. Resolution: 5nm 扫描电子显微镜照片在从牛蛙内耳的毛囊细胞伸出的硬纤毛(A). 用微分干涉差显微镜观察到同样的结构(B).电子显微镜观察的薄的部分 (C).细胞工程技术一、细胞培养二、细

9、胞融合三、显微操作细胞培养（cell culture）概念 是指从活体中取出的细胞或其他建系细胞，在体外给予一定的条件进行培养，使其能继续生存、生长和繁殖的一种方法。细胞培养的用途1）直接观察活细胞的形态、结构和生命活动的过程。2）直接施加物理、化学和生物因子，观察对细胞影响。3）可将不同种类的细胞混合培养，研究细胞间的相互作用。4）配合其他的实验技术可作大量的研究工作，如细胞周期与调控、细胞衰老等。5）为植物育种开辟新途径，为疫苗生产、药物研制提供新手段。细胞培养的条件1）温度2）pH值3）营养物质4）无菌条件A.动物细胞培养B.植物细胞培养C.非细胞体系D.细菌的培养E.病毒的培养细胞培养

10、的种类动物细胞培养的特点1）能显示来源组织的分化特征。例如：成纤维细胞仍能分泌胶原;神经细胞伸展出具有电兴奋作用的轴突。2）可从组织的不同类型的细胞混合群体中纯化某种类型的细胞，便于单因素的分析。3）取材容易，使用方便。细胞培养的方法1）贴附型：能在玻璃或塑料瓶壁 上平展生长，形成单层细胞层。 如上皮型细胞、成纤维型细胞等。2）悬浮型：不贴附于支持物上， 呈悬浮生长，胞体呈球形。 如淋巴细胞等。原代培养和传代培养原代培养（primary culture）1）概念 直接取材于有机体组织的细胞培养。2）步骤 取材剪碎 胰酶消化将细胞分散置合适的培养基培养，一般数小时即可贴壁生长、增殖，直到相互接触

11、铺满瓶壁，形成单层细胞。第一代细胞称为原代细胞。传代培养（secondary culture）：将原代培养的细胞取出，转移到另一盛有新鲜培养液的器皿中进行培养的过程称传代培养。用这种方法可重复传代。细胞系 (cell line)概念培养的细胞中产生了具有无限繁殖能力的变异细胞，这种细胞可被无限地传代，称为细胞系常 用 细 胞 系：细胞系 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 Hela 上皮细胞 人宫颈癌 PTK1 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠植物细胞培养A 单倍体培养B 原生质培养Preparation of hybridoma

12、s that secrete monoclonal antibodies against a particular antigen (X). Monoclonal AntibodiesThe technique for the take apart and gather up of cell, and microscope manipulation Transgenic mice10 weeks44g and 29gMethods to introduce a membrane-impermeant substance into a cell. Gene Knockout miceMario

13、Capecchi (Late 1980s) (University of Utah)embryonic stem cells in inner cell mass as target cells1/104 cells undergo a process of homologous recombination. Step-by-step procedure for the purification of organelles by differential centrifugation.1. 差速离心 （differential centrifugation） 差速离心 在密度均一的介质中，不同

14、大小的颗粒 沉降速度不同，大颗粒沉降快，先到管底， 逐步加大离心力，延长离心时间，可分离细 胞的不同组分。组织匀浆沉淀小块含整个细胞核和细胞骨架低速离心1000g 10min将上清中速离心20000g 20min沉淀小块含线粒体、溶酶体、过氧化物酶体沉淀小块含微粒体小泡将上清高速离心80000g 1小时沉淀小块含核糖体、病毒、大分子将上清超高速离心150000g 3小时2.密度梯度离心(density gradient centrifugation) 在离心管中制备由上到下逐渐增加密度的蔗糖溶液（5%20%），形成密度梯度，细胞匀浆放最上面，这样不同组分以不同速率沉降，形成不同的沉降带，分别收

15、集，进行分析。密度梯度离心The separation of small molecules by paper chromatography. 3. Paper chromatographyThe separation of molecules by column chromatography. 4. Column chromatography离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析5. chromatography细胞组分的分析方法一、组织化学和细胞化学法二、免疫化学法三、分子细胞生物学技术金属沉淀法福尔根(Feulgen)反应 联苯胺反应脂溶染色法茚三酮反应一、组织化学和细胞化学法二、免疫化学法蛋

16、白印迹法(western blot)SDS polyacrylamide-gel electrophoresisSDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS).（一）DNA序列分析（二）核酸分子杂交技术 (RNA) Northern blot, (DNA) Southern blot（三）聚合酶链式反应技术（PCR)（四）放射自显影术三、分子细胞生物学技术双脱氧链末端终止法测序原理示意图 PCR反应过程示意图In situ hybridization for RNA localization in tissues. Tracing and Assayi

17、ng Molecules Inside Cells3H-白氨酸 脉冲追踪实验胰腺细胞的白氨酸5分钟对照 荧光检观察的细胞内Ca2+ 浓缩过程Fluorescent analogue cytochemistry. Fluorescence micrograph of the leading edge of a living fibroblast that has been injected with rhodamine-labeled tubulin. 显示成纤维细胞的微管蛋白其他的细胞生物学技术A fluorescence-activated cell sorter. 流式细胞计数仪Freeze-etch electron microscopy冰冻蚀刻电子显微镜 使用Figure 3-33. The production of hybrid cells. Human cells and mouse cells are fused to produce heterocaryons, which eventually form hybrid cells. These particular hybrid cells are useful for mapping hu