采用电位滴定法测定植物提取液中甲酸脱氢酶活性的实验教学

1、采用电位滴定法测定植物提取液中甲酸脱氢酶活性的实验教学摘要：综合性、设计性实验能更好地激发学生的学习兴趣和培养学生的科研思维。为促进新疆大学“双一流”专业教 学改革和实验室建设，培养学生成为应用型创新人才，该文设计了一个基于电位滴定测定植物叶片中甲酸脱氢酶活性的综 合性实验教学案例，并已成功应用于化学专业本科生实验教学中。实践结果表明，该案例紧密衔接本科生基础课实验教学， 强调“问题引出” “解决思路”和“实践验证”的流程完整性及连贯性，不但设计性和能动性强，且兼顾综合性与实用 性，能够有效地启发和培养学生的创新思维和实践能力，适用于化学、环境、生物等相关专业的高年级本科生的实验教学。关 键

2、词：实验教学；创新思维；植物；甲酸脱氢酶；电位滴定An Experimental Teaching Case of Determination of Activity of FormicAcid Dehydrogenase in Plant Extracts by Potentiometric TitrationAbstract: Comprehensive and designed experiments can better stimulate students interest in learning and cultivate their scientific research thi

3、nking. To promote the teaching reform and laboratory construction of Double First-Class major in Xinjiang University and train students to become application-oriented innovative talents, a comprehensive experimental teaching case was designed based on the determination of the activity of formate deh

4、ydrogenase in plant leaves by potentiometric titration, which has been successfully applied to the experimental teaching of undergraduate students in chemical specialty. The teaching practice showed that the case was closely connected with the experimental teaching of undergraduate basic course, emp

5、hasizing the process integrity and coherence of problem elicitation, solution thinking and practice-based verification. The design was not only creative and initiative, but also comprehensive and practical. It could effectively inspire and cultivate students innovative thinking and practical ability

6、, suitable for chemical, environmental, biological and other related professional senior undergraduate experimental teaching.Key words: experimental teaching; innovative thinking; plants; formate dehydrogenase; potentiometric titration培养具有创新精神和实践能力的各类创新 型、应用型、复合型优秀人才是高校实现一流大 学和一流学科建设的根本任务，也是衡量一流大 学办

7、学水平的重要指标1-2o应用型创新人才是指 面向生产、建设、管理等领域的需求，介于“学 术性、理论型”研究人才和“职业性、技能型” 岗位人才之间的一种“应用型、技术性”创新人才, 是我国今后相当一段时间内大量急需的人才类 型3-4o创新型人才培养的突出特点是始于问题、 源于实践，其重点是要强化实践教学环节5-6o实 践教学是理工科专业本科教学中极为重要的一个 环节，在培养学生创新意识、创新精神和创新能 力方面具有不可替代的作用7-8o酸碱滴定是分析化学基础实验课程的一个 重要知识点，在化学的定量分析中占有举足轻重 的地位9o电位滴定法是在滴定过程中通过测量电置，以提高滴定结果的准确性和重复性，

8、如图3 所示。图1实验设计思路图2精密pH置，以提高滴定结果的准确性和重复性，如图3 所示。图1实验设计思路图2精密pH计1一碱式滴定管，2精密pH计, 3离心管，4复合电极，5磁子，6烧杯，7磁力搅拌器，8一铁架台。!2pH计图3自制简易电位滴定装置图位变化以确定滴定终点的方法，是滴定原理的一 种应用形式，适用于待测溶液有色或浑浊及不符 合目视法确定滴定终点的情况，靠电极电位的突 跃来指示滴定终点10-11o电位滴定具有操作简 单、方便、费用低、准确度高、应用范围广泛、 便于普及与推广的优点，是值得高校本科生掌握 的一项实验操作技能12o植物提取液常常具有一 定的色度，因而电位滴定法适于测定

9、其中的酸度 变化。1实验设计思路及意义甲醛是一种常见的室内空气污染物，长时间 接触会对人体产生强致癌致畸的危害13o近年来 室内空气中甲醛污染的高效净化技术已成为相关 领域的热点问题14o各类技术中，因绿色植物净 化具有成本低、清洁安全、无二次污染等优点， 而受到广泛欢迎15o空气中的甲醛通过叶面吸收作用进入植物体 后，可通过氧化途径转化为甲酸，再分解为二氧 化碳和水，从而达到“解毒”效果16-17o植物正 常生长下产生的甲酸会被植物体内的甲酸脱氢酶 自身分解，不会影响植物体生长，但受甲醛污染 等外界刺激时，甲酸脱氢酶不能快速分解产生的 过量甲酸，会造成植物体内的甲酸累积，导致植 物“酸中毒”

10、，减弱甚至失去甲醛净化能力，并 影响植物生理功能18-19o因此，甲酸脱氢酶活性是评估和预测植物甲 醛耐受性及筛选甲醛高效净化植物的重要指标之 一。本实验以热变性酶的方式制备酶失活植物提 取液（简称失活提取液），采用电位滴定法，通过 测定外加甲醛后植物新鲜提取液和失活提取液中 甲醛含量的减少值，及外加甲醛前后植物新鲜提 取液和失活提取液中酸度变化的差异，达到定量 评估植物中甲酸脱氢酶活性大小的实验目的，实 验设计思路如图1所示。2实验原理依据国家标准GB/T 20932011，工业中甲酸 含量的测定采用酸碱滴定法。由于植物中甲酸 含量较低和植物提取液研磨后自身存在颜色， 采用目视滴定法手工振荡

11、会因人为主观因素引起 较大的滴定误差，因此我们用常见的精密pH计 （如图2所示）和磁力搅拌器组装简易电位滴定装3主要药品和仪器3.1主要仪器1）电动离心机：TDL-50,江苏金坛仪器厂。2）恒温水浴锅：HH-WL,江苏省金坛市医疗 仪器厂。3）精密pH计：PHS-3C，上海虹益仪器仪表 有限公司。4）电子天平：BSA224S，赛多利斯科学仪器 （北京）有限公司。5）紫外分光光度计：T6新世纪，北京普析通 用仪器有限责任公司。6）大盘面磁力搅拌器：IKA,莱贝（上海）科学 仪器有限公司。3.2主要试剂1）甲醛使用液：取0.70 mL甲醛（含甲醛37% 40%）定容到250 mL容量瓶中，用已知准

12、确浓度 的硫代硫酸钠溶液标定其准确浓度。取上述标定 溶液 35.00，50.00，75.00 mL 定容至 100 mL 容量 瓶中待用。2）氢氧化钠溶液：称取0.50 g氢氧化钠，溶 解于500 mL新蒸蒸馏水中，用邻苯二甲酸氢钾溶 液标定后待用。4实验步骤4.1实验前分组设计实验方案中共设计3个变量：植物种类（6种）、 植物质量与提取剂体积的比例固-液比（g : mL） 设为1：5, 1 : 10，1 : 20和外加甲醛浓度（350, 500，750 mg/L）。将新疆大学化学化工学院化学 16-1班的37名本科生自由组合的方式分成6个大 组，每个大组选择同一种植物，共同采集样品并 进行前

13、处理；每个大组再根据植物与水提取液比 例的不同分成3个小组），每小组内同学分工协 作，共同完成3方面的实验内容：1）两种提取液 的制备；2）测试两种提取液对外加甲醛的净化能 力；3）外加不同浓度甲醛前后植物提取液中酸度 的变化。4.2植物样品采集、预处理和提取液的制备实验所需的植物样品均由学生在校内草坪、 荒地及校外公园空气清新、土壤无污染历史处采 集并记录准确位置，每个小组将植物样本进行分 类。每次所用植物样品均需新鲜采集，经短途保 鲜运送回实验室，立即用预冷的自来水和蒸馏水 依次清洗表面，拭干后待用。准确称量预处理好的植物样品置于瓷研钵 中，将瓷研钵置于冰盒上，在04龙预冷12 h的 无二

14、氧化碳蒸馏水为提取液，按前述预设比例分 34次加入提取液，每次均快速研磨以提取出新 鲜植物叶片中的有效成分，分离出的新鲜提取液 转移至同一预冷的离心管中混匀，在04龙离心 10 min，分离上清液并均分成两份，一份立即进行 外加甲醛实验，即为植物新鲜提取液；另一份密 封于试管中，放入100龙沸水中加热10 min后冷 却，即为植物酶失活提取液（简称为失活提取 液）。所制备的提取液均需密封后置于04龙冰箱 中短时间保存。4.3植物提取液的酸度变化在100 mL离心管中依次准确加入20.00 mL 植物提取液、8.00 mL甲醛溶液，放入磁子将混合 液在磁力搅拌器上充分搅拌1 min，记录初始溶液

15、 的pH值。随后用准确标定后的0.025 mol/L氢氧 化钠溶液进行电位滴定，观察并记录每次加入一 定体积氢氧化钠溶液后，混合液反应完全后的 pH值。当混合液的pH值接近11左右停止滴定 （实验均设3个平行）。两种提取液需分别进行不加甲醛的空白实 验。具体步骤为：将前述的8.00 mL甲醛溶液改 为预冷的蒸馏水，其余操作与前述相同。4.4植物提取液对外加甲醛的净化能力在12个具塞比色试管中分别加入0.50 mL离 心后的新鲜或失活植物提取液，分别加入0, 350, 500，750 mg/L的甲醛使用溶液100应（每个浓度 设三个平行），再分别加入0.50 mL乙酰丙酮，蒸 馏水定容5.00

16、mL,摇匀，置于60水浴中加热 15 min后，冷却、过滤、稀释后，在波长414 nm 处，以水为参比，测定滤出液的吸光度值，完成 外加甲醛净化实验。4.5数据处理与结果分析4.5.1数据计算与处理甲醛变化量：根据标准曲线和加入甲醛前后 两种植物提取液吸光度的变化值，计算出净化反 应完成后两种植物提取液中甲醛浓度减少值 （m鲜样理论值，m失活理论值），按原理即实际提取液中 甲醛减少量=理论提取液中甲酸生成量。甲酸脱氢酶活性评价：根据消耗的氢氧化钠 浓度和体积及所对应的pH值，绘制出滴定曲线。 根据相同条件下两种提取液达到滴定终点时消耗 氢氧化钠的体积和净化甲醛量，计算植物新鲜提 取液中甲酸脱氢

17、酶的活性大小。具体计算方法：1）对比植物空白实验结果，根据滴定曲线中 突跃范围对应的氢氧化钠浓度和体积计算出新 鲜提取液外加甲醛后混合液中甲酸含量的实际值 m鲜样实际滴定值。2）与第一步相同的方法计算出失活提取液外 加甲醛后混合液中甲酸含量的实际值m失活实际滴定值。3）根据两种提取液甲醛减少值计算出滴定中 甲酸含量的变化值（Am新鲜，Am失活）。4）新鲜提取液的Am新鲜与失活提取液的Am失活 间的差值，即为新鲜提取液中由甲酸脱氢酶作用 导致的甲酸降解量，进而判断出新鲜提取中甲酸 脱氢酶活性大小。Am新鲜=m鲜样理论值-初鲜样实际滴定值Am失活=m失活理论-初失活实际滴定值Am=Am鲜样_Am失

18、活4.5.2结果分析以某组学生做的落地生根叶实验数据为例 进行数据计算与结果分析。当外加甲醛浓度均 为500 mg/L，计算出植物质量和提取剂的比例 不同时甲酸脱氢酶的贡献（此），实验数据如表1 所示。表1植物质量和提取剂的比例不同时甲酸脱氢酶的贡献固液比刀鲜样理论刀失活理论队鲜样实际滴定值刀失活实际滴定值侦鲜样侦失活Am1:5293.46148.181 495.91 657.080001:10157.8799.76161.11471.810001:20148.1875.54057.54148.1818.01130.181）落地生根质量和提取剂1 ： 5时，提取液 的滴定曲线如图4（a）和图4

19、（b）所示，在两种提 取液中加入甲醛后，滴定曲线均向右平移，首 先表明混合液中甲酸含量有所增加，即可证明 加入到植物新鲜提取液中的甲醛，在甲醛脱氢 酶的作用下将甲醛先转化为甲酸，由于甲酸脱 氢酶活性较小，不能够完全降解植物提取液中 的甲酸，进而导致提取液中甲酸含量增多，其 甲酸含量的增加对甲酸脱氢酶活性产生了抑制 作用。2）落地生根质量和提取剂1 ： 10时，提取 液的滴定曲线如图4（c）和图4（d）可以看出，植 物提取液加入水的曲线和加入甲醛的曲线接近 重合，原因可能是随着植物提取液比例的增大 导致降解外加甲醛的活性物质的含量降低，使 得空甲醛转化为甲酸的含量减少，曲线接近于 重合。3）落地生根质量和提取剂1 ： 20时，提取 液的滴定曲线如图3（e）和图3（f）可知，随着植 物质量和提取剂比例不断地增大，新鲜提取液 中滴定曲线与空白曲线相比，显著向左偏移， 表明加入甲醛后生成的甲酸被植物提取液中的 甲酸脱氢酶快速分解，由于甲酸脱氢酶活性较 大除了把外加甲醛生成甲酸降解外，也降解植 物提取液中的本身存在的甲酸。实验结束后，由学生逐一计算出不同实验 条件下植物提取液中甲酸脱氢酶活性，大组内 讨论甲醛加入量、植物质量与提取液体积的比 例（固-液比）对甲酸脱氢酶活性的影响；再根据 6