克隆与医学课件

1、克隆与医学引 言 克隆的一般概念 动物克隆的发展历史 动物克隆技术的基本方法和原理 动物克隆存在的问题 动物克隆技术的应用前景 克隆的一般概念 克隆：是指通过无性方式由单个细胞或个体产生的和亲代非常相似的一群细胞或生物体，在不发生突变的情况下，一个克隆内的所有成员具有完全相同的遗传构成。细胞克隆: 指的是一个祖先细胞经过分裂，增殖而形成一群细胞，这些细胞具有相同的遗传组成，该群细胞中的每一个细胞都含有相同的遗传组成和特性，也称无性繁殖细胞系。分子克隆：利用DNA重组技术将特定基因或DNA序列插入载体或利用PCR技术获得大量相同基因或DNA序列的过程。 个体克隆：生物体克隆，是指用无性繁殖的方

2、法，从体细胞得到遗传上与原来生物体完全相同的 生物体，即人工复制生物体。 组织器官克隆：将体细胞核移入到去核的卵细胞 形成重构胚，经过一定处理，待发育到囊胚后，分 离胚内细胞团 ，纯化、培养、筛选胚胎干细胞，定 向诱导分化成预定组织和器官的过程。 Gottlieb Haberlandt the father of plant tissue culture August Weismann动物克隆发展历史-萌芽阶段a founder of experimental embryology Wilhelm RouxThomas J. King 1952年，在豹蛙的一系列实验中，40%的重组卵发育成胚胎

3、、蝌蚪和幼蛙，这是人类第一次培养出的细胞核移植蛙，即克隆蛙。他们的研究结果发表在1952年3月出版的美国国家科学院院刊上。Robert W. Briggs现代克隆技术的开端John Gurdon1974年 Davor Solter1983年，Davor Solter和David McGrath两人首先建立了哺乳动物核移植的类似程序，将小鼠胚胎细胞与去核卵母细胞融合，但是他们没有克隆出小鼠。 In 1986, while working at Grenada Genetics, Steen Willadsen cloned a cow using differentiated, one week

4、 old embryo cells. The work proved that the genetic information of a cell did not diminish as a cell specialized and that DNA could return to its original state. Willadsen never officially published his results, but the work was a strong influence in Ian Wilmuts decision to attempt to clone from adu

5、lt cells, which he accomplished in the famous 1996 birth of Dolly.On July 5, 1996, Dolly, the first organism ever to be cloned from adult cells, was born. Ian Wilmut and Keith Campbell, researchers at the Roslin Institute in Scotland created Dolly using a technique similar to that with which they cr

6、eated the first sheep from differentiated embryo cells in 1995多莉及其以后的发展 克隆牛 （Kato,1998） 克隆小鼠 (Wakayama,1998)克隆猴“太特拉” 克隆猫CC (威苏辛,2002)克隆兔 (保罗雷纳德,2002)克隆马“普罗梅泰亚”在意大利出生。后面是它的“母亲兼姐姐”。克隆骡子 (戈登伍兹,2003）我国动物克隆研究童第周童第周和严绍颐等合作在1963年7月出版的科学通报上发表题为鱼类细胞核移植的论文(英文论文发表于1965年的科学通报)，首先向国内外报道了鱼类的核移植：以金鱼和鳑鱼为材料，曾于1961年开

7、始进行鱼类细胞核移植，经过两年的摸索，证明细胞核的移植也可以在鱼类中进行。 克隆山羊“阳阳”降生在中国西北农林科技大学种羊场。中国第二头克隆牛“科科”目前状况一切正常。2005年4月，国际首例体细胞克隆亚洲黄羊在山东临沂顺利降生 供体黄羊的成纤维细胞受体山羊的卵母细胞陈大元研究员 课题组 2005年8月5日李宁教授领导的课题组经过一年多的科技攻关，一头体重1130克的克隆小香猪于在河北省三河市明慧养猪公司顺利诞生。 杜淼 研究员陈大元中国异种克隆之父 周琪李宁“ 973”项目“农业动物遗传育种与克隆的分子生物学基础研究”首席科学家 动物克隆技术的基本方法和原理原理：细胞的全能性。动物中几乎所有

8、的细胞都含有完全相同的遗传信息，具有发育的全能性。而受体细胞质中含有启动细胞核重新编程的各种因子，供体核在卵细胞质因子的作用下，可以重新回到未分化的状态。高等动物克隆的三条途径胚胎分割技术体细胞与去核卵细胞融合技术细胞核移植技术胚胎分割技术：在细胞期至囊胚期以前的早期胚胎用酶或机械方法分割，然后由分割的细胞分别发育成个体体细胞与去核卵母细胞融合技术供体细胞不一定是核，可以是含部分细胞质的细胞甚至是整个细胞；不进行核移植，而是通过细胞融合技术，使供体细胞与去核卵细胞融合获得重构胚。细胞核移植技术显微操作仪Step 1. 供体细胞的准备供体细胞的类型 胚胎细胞胚胎干细胞体细胞2. 供体细胞所处的细

9、胞周期与克隆效率供体核处在GO/G1期：容易获得最佳克隆效果这时的细胞虽然代谢比较活跃，但细胞却置身于细胞分裂周期之外；供体核处在/G期：受体卵母细胞质指导的潜在的基因组复制将导致异常的发育。3. 获取期供体细胞的方法人工捕获的方法：通过限制细胞培养基中的某种成分，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶段，Wilmut等就是通过该种方法获取G0期细胞的；通过选择细胞类型来获得：对于不同类型的细胞，其在细胞周期的不同阶段上的细胞数目相差很大，如刚排出的卵母细胞其周围的卵丘细胞90%以上处于G0期或G1期。Wakayama等就是通过该方法获得处于G0或G1期的供体核的。 4. 供体细胞细胞核的获得

10、Step 2 受体细胞的准备.受体细胞的类型：极体期：激活后的卵母细胞MPF的作用MPF(Mature meiosis/metosis promoting factor)的活性在卵母细胞成熟过程中的第一次和第二次减数分裂中期最高，而MPF水平的高低可影响供体染色质的状态和复制，MPF的作用可使供体核核膜破裂，发生早熟染色体凝集（PCC, premature chromosome condensation），不利于维持染色体的倍性。2. 受体细胞的周期与克隆效率：胞浆中的MPF水平很高，只能接受处于G0或G1期的供体细胞 原则：受体细胞与供体核的周期要匹配期：激活后的卵母细胞 。MPF的水平下降

11、，原则上可以采用任何细胞周期的供体细胞 3. 去核卵母细胞的获得卵母细胞的获得：通过超排卵来获得，或卵巢的卵泡，经体外培养成熟而获得 超排卵：通过注射激素：PMSG（孕马血清促性腺激素）、hCG（人体绒毛膜促性腺激素）、FSH(卵泡刺激素)。 以兔的超排为例：挑选处于发情间期性成熟的雌性家兔（6-8月龄），肌肉注射FSH共30单位（分6次，每次间隔12小时），最后一次肌肉注射FSH 12小时候，静脉注射hCG 100单位，在注射hCG 13hr后，经过外科手术，用PBS冲洗输卵管回收处于M期的卵母细胞。回收处于M期的卵母细胞 输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 子宫角冲胚 子宫内膜子宫肌层子宫外膜

12、卵巢发育中的卵泡输卵管壶腹部卵泡破裂排卵输卵管子宫卵母细胞的去核：Step 3 核移植形成重构胚带下移植细胞质内注射1. 核移植2. 融合和激活培养方法 微滴培养法是利用塑料平皿制成50l培养液小滴数个，每滴加入一定数量胚胎，在上面覆以灭菌且平衡好的液体石蜡。或先将液体石蜡倒入平皿中，用注射器吸培养液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后将培养皿放到5CO2、95空气饱和湿度的37.5 CO2培养箱中培养所需要的时间。如果更换培养液，应在实体显微镜下，用注射器或口控微吸管将培养液吸出，并加入新培养液，继续培养。 输卵管培养法取发情动物的输卵管洗涤后，置于培养皿中，培养液面超过输卵管，将同种或异

13、种动物的胚胎自伞口注入输卵管，进行培养。 CO2培养箱移植到受体子宫角或输卵管多莉与她的 代理妈妈克隆动物存在的问题多莉的一生43427713291总成功率：0.23%克隆效率低1998年9月，多莉与威尔士山羊交配，自然怀孕生下一健康小羊，取名“邦尼”2003年2月14日，研究人员对多莉实施了“安乐死”早衰？ 克隆动物毛病一大堆：克隆鼠“发福”我国成功繁殖克隆兔体形要比普通兔大许多。克隆效率极低（小于3%);胚胎、胎儿或新生儿死亡率高；全程发育的也表现为超重、呼吸系统疾病等异常表型；表型正常的也存在免疫缺陷、关节炎或肾、脑畸形。造成克隆效率低, 克隆动物异常等问题的可能原因如下： A. 核移植

14、前胚胎损伤 B. 体外培养的时间过长以及培养液成份 C. 体细胞核在卵质中去分化和再程序化不足 D.一些重要基因的异常表达 （研究发现一些重要的发育相关基因如IL6,FGF4,FGFr2, 和Oct4在克隆桑葚胚和囊胚中表达异常。在牛的克隆桑葚胚中发现Mash2表达过量，DNMT表达不足，Hsp70表达消失）克隆的意义及应用前景发育生物学研究方面：克隆技术为研究核质关系，去分化及再程序化提供了实验技术平台。畜牧业：利用体细胞克隆技术获得优良个体的复制品，理论上从一个个体可以产生出无数的克隆动物后代，从而最大限度扩大优良个体的数量，提高生产水平。骡子挽救濒危动物：“条件成熟时甚至还可以将灭绝物种

15、恢复原状，例如取出掩埋于冰川底下已灭绝动物的体细胞，通过克隆让它们再现于地球”；陈大元等从事大熊猫的异种克隆工作。与转基因动物相结合：动物乳腺生物反应器把目的片断在器官或组织中表达的转基因动物叫生物反应器 动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物,指导外源基因在乳腺中表达, 并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白. 产量高，且易收获目标产品，可以随乳汁分泌而排出 动物体外； 目标产品的质量好。动物乳腺组织不仅具有按遗传信 息流向合成蛋白质的能力，而且具备一整套对蛋白进 行修饰和加工的能力，如糖基化、羧化、磷酸化以及 分子组装等，而微生物和植物系统都不具备这种全面 的蛋

16、白质后加工能力； 产品成本低； 从奶牛中提取产品，操作比较简单。 基因工程牛奶：在乳腺中表达乳糖酶 表达人的乳铁蛋白基因 可抑制有害细 菌增殖,促进双歧杆菌等有益菌的增殖, 可通过与铁和锌络合, 由肠粘膜上的受 体介导帮助人对铁和锌的吸收。人源化牛奶：将牛的乳蛋白基因替换 成人的乳蛋白基因, 使牛奶更接近人奶 治疗性克隆由患者提供体细胞，将克隆技术和胚胎干细胞技术相结合，获取预定的细胞、组织和器官，在通过移植技术植入病人体内达到治疗的目的。 技术路线 取患者体细胞，体外培养，使细胞同步化显微注射移入去核卵母细胞构建重构胚体外培养至囊胚分离细胞团，获得胚胎干细胞对胚胎干细胞进行基因修饰，定向诱导分化移植入患者病变部位，替代病损细胞、组织 器官