枯草芽孢杆菌信号肽依赖分泌表达系统研究进展

1、枯草芽抱杆菌信号肽依赖分泌表达系统研究进展摘 要:枯草芽孢杆菌作为研究革兰氏阳性菌的模式菌，遗传背景清楚，培养方法和基因操作简易，没有致 病性,是优良的基因工程表达系统，特别是利用枯草芽孢杆菌表达系统高效生产优质蛋白，是基因工程研 究领域的热点。在枯草芽孢杆菌分泌胞外蛋白过程中信号肽依赖分泌表达是主要途径，本文主要概述了 枯草芽孢杆菌表达系统中信号肽以及信号肽依赖分泌途径的研究进展，并对该表达系统的研究前景进行 展望，进而提出今后的研究方向和重点。关键词：枯草芽孢杆菌;信号肽;蛋白分泌Advances in the Study of Signal Peptide Dependent Expre

2、ssionSystems in Bacillus SubtilisAbstract. Bacillus subtilis is a model bacterium for the study of gram-positive bacterium. It has simple heredity background, easy to culture and operate, no pathogenic, so it is an excellent gene engineering expression system, in particular. The use of bacillus subt

3、ilis expression system to produce high quality protein is a hotspot in the field of genetic engineering. Secret-dependent expression of signal peptide is the main pathway in the process of extracellular protein secretion by bacillus subtilis. In this review, the research progress of signal peptides

4、and its secret-dependent pathway in the expression system of bacillus subtilis was summarized, the existing problems of this expression system are summarized, and the future research direction and emphasis were put forward.Key words: Bacillus subtilis; signal peptides; protein secretion大肠杆菌是目前掌握最为成熟

5、的基因克隆表达 系统,经常被用作蛋白质分泌和表达的宿主菌，它遗 传背景清晰、转化效率高、表达周期短、操作简单，因 此使用范围很广。但是大肠杆菌也有一些不足之 处:大肠杆菌表达的蛋白质形成包涵体，给下游的纯 化处理带来不便，同时有些表达蛋白无法分泌至胞 外，不利于测定酶的活性和直接使用*枯草芽孢 杆菌是基因工程中又一个被广泛使用的表达系统, 常作为表达酶和外源蛋白的宿主菌使用。对于枯草 芽孢杆菌的研究可以追溯到100年前，初期侧重于 形态观察等方面的研究，1958年Spizizen在实验中 采用了化学试剂，进而制备了枯草芽孢杆菌的感受 态细胞，极大地促进了其在基因工程研究方面的进 展* 1997

6、年，枯草芽孢杆菌模式菌株168的基因 组完成测序，全基因组共4.2Mb,含有4214810个碱 基，200个调控蛋白参与1500个操纵子的调控，蛋白 编码序列占87%的基因组*在4106个蛋白质编码 基因中，已经可以明确或预测约58%的蛋白质编码 基因功能和约30%的产物功能，为研究枯草芽 孢杆菌蛋白质的分泌机理提供了重要理论依据，推 动了相关研究的进行*现在枯草芽孢杆菌已经成 为一种成熟的基因工程表达系统，饲料、食品等行业 大多利用枯草芽孢杆菌高效表达系统来生产内源生 化产物，其应用之广仅次于大肠杆菌*1枯草芽孢杆菌基因表达系统的优势1.1容易获得枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤、腐败的有机物 以

7、及水环境中，容易在枯草浸汁中繁殖。1.2遗传操作简单枯草芽孢杆菌的基因组测序已于1997年完成， DNA遗传背景清晰，便于操作刃。质粒载体如 pUB110、pC194、HCMC和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌 穿梭质粒如pHT43、pSP10等的研究应用，为枯草芽 孢杆菌在基因工程中的发展应用提供了便利* 1.3蛋白分泌系统功能完善枯草芽孢杆菌蛋白质分泌能力强，可以实现对 多种蛋白质的有效分泌，分泌的时候，并不存在包涵 体的形成,可以直接透过细胞膜向培养基释放，回收 纯化目的蛋白质方法简单，1.4发酵工艺成熟枯草芽孢杆菌嗜温好氧，培养基配方简单,代谢产 物中含有蛋白酶、淀粉酶等酶类,在工业上应用成熟*

8、 1.5非致病性生理生化背景清晰，细胞壁组成简单，只含有肽 聚糖和磷壁酸，不含内毒素，可以在动物肠道中繁 殖,为正常的肠道微生物，被美国食品药品管理局认 为是生物安全级别的微生物，在饲用酶和益生菌的 生产上具有极大的优势9*2枯草芽孢杆菌信号肽依赖分泌胞外蛋白途径在外源基因的克隆表达过程中，重组蛋白一般 以3种形式表达，包括细胞外的分泌表达、细胞内的 可溶性表达和在细胞内形成不溶性的胞涵体*枯草 芽孢杆菌为格兰氏阳性菌，只有一层细胞膜,蛋白可 直接分泌至胞外而不形成胞涵体，其表达产物多数 具有天然构象和生物活性,产物较易纯化,极大地方 便了外源蛋白的下游加工和酶活测定，经枯草芽孢 杆菌分泌的很

9、多外源蛋白质已经应用于益生菌、酶 制剂等工业生产领域，占有很大的市场份额*根 据SubtiList数据库提供的Signal?算法软件，共294 种蛋白质被预测为分泌蛋白质S*根据蛋白质分 泌是否涉及到信号肽，可以将分泌途径分为两种:信 号肽依赖以及不依赖的分泌途径M*其中枯草芽 孢杆菌分泌的蛋白质大部分是依托于信号肽依赖的 分泌途径分泌至胞外，因此这种途径也称为典型性 途径*2.1信号肽的研究进展20世纪70年代初，美国的细胞生物学教授 Gunter Blobel提出信号肽假说。该假说理论认为信 号肽位于蛋白的N端,可以结合并引导核糖体附着 在内质网的极性通道内，肽链不断延伸并穿过内质 网膜，

10、进而延伸到腔内，信号肽酶水解信号肽，正确 折叠肽链，进而实现向胞外的转运皿。信号肽是一 段连续的氨基酸序列，用于指导蛋白质跨膜运输，它 一般由10 40个左右的氨基酸残基构成，包括三个 区域:氨基端区（N端）、疏水端区（H端）和羧基端区 （C区）。其中N端由赖氨酸和精氨酸等带正电荷的 氨基酸组成，氨基酸残基与细胞膜带负电荷的磷酸 基团相互作用。H端的长度以及疏水性在蛋白分泌 中起着重要的作用，主要由异亮氨酸等20个或超过 20个的中性氨基酸构成，疏水氨基酸残基接触到膜 脂，形成！螺旋结构，在蛋白质跨膜转位起始阶段发 挥重要作用。+区又称为加工区，存在丝氨酸等小 分子氨基酸，在蛋白转位中或转位后

11、，信号多肽在C 区被信号多肽酶识别并切割，随后信号多肽被降解, 蛋白质被释放至胞外问。细胞外分泌表达是外源基因克隆表达中最为理 想的表达形式，但是大部分外源蛋白都会在细胞内 形成包涵体，只有少数外源蛋白可以在细胞外分泌 表达。为了让许多原本不能分泌至胞外的外源蛋白 进行细胞外分泌表达，目前解决方法多为直接利用表 达宿主的信号肽序列或对载体的启动子进行表达后 插入编码信号肽序列来引导外源蛋白胞外分泌。 有研究表明，信号肽连接后，在大肠杆菌、芽孢杆菌 和乳酸杆菌等原核表达系统中分泌和表达了多种外 源基因。同时信号肽在毕赤酵母等真核表达系统中 也得到了广泛的应用。如魏蔷等将信号肽插入猪瘟 病毒E2蛋

12、白基因，实现了该基因在杆状病毒表达系 统中的分泌表达，其中gp67信号肽可使E2基因分泌 表达量、纯度、产率都得到较大提高诚。祝发明等构 建了枯草芽孢杆菌Tat信号肽，实现了青霉素G酰化 酶（PGA）在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，其中最佳信 号肽可引导PGA的表达酶活高达0.83U/mL17。但 是信号肽与目的蛋白质之间具有适配性，如Brock- meier等人以角质酶和脂解酶为例，通过高通量筛选 的方法建立了信号肽文库，以期有效筛选枯草芽孢 杆菌sec途径中的148个信号肽。结果显示,两者间 并不存在对应关系,148个信号肽能引导角质酶基因 在枯草芽孢杆菌中表达，但最有效促进角质酶分泌 的信号

13、肽引导脂解酶分泌的水平很低，仅为最高分 泌量的5%阀,即使是同一种蛋白，用类型不同的信 号肽进行引导,多数均可以表达,但分泌效率显著不 同。因此选择合适的信号肽是影响蛋白质产量的重 要因素。2.2枯草芽孢杆菌分泌胞外蛋白途径枯草芽孢杆菌中至少存在4种信号肽依赖分泌 途径,具体为Sec途径、Tat途径、ABC转运子途径和 假菌丝蛋白输出途径询。ABC转运子途径和假菌 丝蛋白输出途径只输出特定蛋白质，且分子量相对 较小，目前研究较为清楚的是Sec途径和Tat途径， 其中Sec途径广泛应用于枯草杆菌分泌蛋白质，信 号肽分为两类:I型普通型信号肽、C区含有脂蛋白 盒子的2型信号肽。Tat途径通常情况下

14、仅对组装 成熟的蛋白质进行分泌，信号肽中一般包括两个相 邻氨酸残基如。_Sec（ general secretory pathway） 转运途径。Sec 途 径是主要的蛋白分泌途径，很多文献中外源表达蛋白 的分泌主要依托于Sec途径来实现囱，对于枯草芽孢 杆菌来讲,大约存在着三百种分泌蛋白，很多分泌 蛋白向胞外的转移主要依托于Sec途径来实现,Sec 转运系统在转运过程中,发挥着重要作用的编码蛋白 为 SecA、SecD、SecE、SecF、SecY、ffh、ftsY * SecA 本质 上属于一种ATP酶,依托于ATP的水解驱动分泌蛋白 前体穿膜，而SecYEG的构成主要包括了 SecE、S

15、ecY 和SecG，从蛋白转移酶的角度来说,SecD7和SecF作 为其重要的辅助成分地。在Sec途径中，核糖体会先 合成有着信号肽的分泌蛋白前体,此时蛋白为未折叠 状态。Sec蛋白的ATP酶对ATP进行水解,信号肽在 这种情况下将会引导分泌蛋白前体，向细胞膜外的转 移主要依托于极性通道来实现,通道蛋白的构成主要 包括了一组膜蛋白，其主要的职责是对分泌蛋白的细 胞质进行定位和转移药,分泌蛋白以肽链形式在转移 阶段存在。在穿过细胞膜后，信号肽酶在C区切除信 号肽，蛋白质被正确折叠，并穿过细胞壁，最终作为成 熟蛋白分泌到培养基中菌，详见图1财。图1 枯草芽抱杆菌蛋白质Sec途径转移机制Sec途径是

16、枯草芽孢杆菌分泌胞外蛋白质的主 要途径，也是酶制剂工业化生产的主要途径，但经 Sec途径可成功分泌的外源蛋白较少,而且表达量并 不高也。主要原因如下：效率较低。Sec转运途径只能将以非折叠 状态即多肽链形式存在的分泌蛋白前体从细胞质转 运到细胞膜外，但在细胞质中已经折叠完全的蛋白 质不能通过该途径转移；蛋白降解。经sec途径转运的外源蛋白在 转移到膜外后才进行折叠，但这一过程比较慢，有时 来不及折叠就会被蛋白酶降解，降低了外源蛋白的 表达量*错误折叠。王光强等尝试用不同的Sec信 号肽来引导分泌表达耐热乳糖酶BgaB，均分泌失 败，利用python语言编写的程序分析表明，细胞质蛋 白质的N端较

17、容易折叠成高级结构，导致外源蛋白 无法进入分泌途径而失败。膜定位能力差。Tat( twin-arginine translocation)转运途径。2000 年Jongbloed等通过功能基因组的分析发现Tat转运 途径,这也是研究较为清楚的另一种蛋白分泌途径, 与Sec转运途径有很大区别的是，该途径可以将折 叠紧密的蛋白或者多亚基酶复合物直接分泌到胞 外，而Sec转运途径只能转移多肽链型式的蛋白。 除枯草芽孢杆菌外，如一些植物叶绿体和细菌如大 肠杆菌等均存在该途径”。Tat途径的典型特征为分泌蛋白信号肽中两个 精氨酸残基相邻,经此途径分沁的蛋白大多数都带 有联精氨酸信号肽。Tat途径由Tat

18、A( 3个TatA/B/ E的同源基因)和TatC( 2个TatC的同源基因)组 成咨，其中3个TatA/B/E同源基因的跨膜和两亲 性双螺旋在蛋白分泌过程中起着关键性的作用。首 先,蛋白信号肽双精氨酸前体与TatC相连，随后 TatC和TatB再相连，在具有跨膜PH梯度下，再连入 TatA，最后,TatB调节转移折叠好的基质从TatC转 移到Tat孔,具体途径如图2湘。图2 枯草芽抱杆菌蛋白质Tat途径转移机制Tat途径的研究多集中于大肠杆菌上,berk等发 现大肠杆菌中Tat基质在辅助因子作用下可以转运 折叠蛋白，Santini和Thomas分别证明绿色荧光蛋白 可以在折叠状态下通过Tat途径在大肠杆菌中转移 至胞外。对枯草芽孢Tat途径的研究较少，主要集中 在与大肠杆菌的Tat途径的对比上，只有很少的蛋白 质可以通过Tat途径分泌，目前仅磷酸二酯酶