荧光光谱在蛋白质结构中的应用

1、荧光光谱在蛋白质结构中的应用李强 0710219黄雄 0710209李承珉 0710214蛋白质结构的研究方法 1.测定溶液中的蛋白质分子构象。如核磁共振法,圆二色谱法, 激光拉曼光谱法, 荧光光谱法。 2测定晶体蛋白质的分子结构。如X射线衍射分析法。 两者的共同之处是可以用蛋白质溶液进行测量，而且不破坏蛋白质的结构。荧光光谱法的优点 荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种有效方法。它能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数, 这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断蛋白质分子在各

2、种环境下的构象变化, 从而阐明蛋白质结构与功能之间的关系。同时, 荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点。所以, 该方法在蛋白质分子构象研究中得到越来越广泛的应用。荧光光谱的测量原理光是一种电磁波。它的频率与波长的关系为： =c/ (1) 式中为频率、为波长、c为光速。荧光光谱的测量原理当光进入某种物质以后，可以有两种情况发生：一种是进入物质后，能量几乎不被吸收；另一种是能量被全部吸收或被部分吸收。 在后一种情况下，在吸收光的过程中，光能被转移给分子。但是吸收本身是一种高度专一的现象，即一定结构的分子只能吸收一定能量的辐射。根据量子理论，分子从光波中吸收能量必定是以不连续

3、的、整份单位的形式发生，这些不连续的微小能量单位称为量子。荧光光谱的测量原理也就是说频率为的单色光的能量必定是h的整数倍。每个量子能量为： E=h=h c/ =hcw (2) h为普朗克常数、w为波数。可见，能量E与波长成反比，波长越长，能量越小荧光光谱的测量原理吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图荧光光谱的测量原理光照射物质时，光子打到分子上，大约在10-15秒内被吸收，原来处于基态的电子被激发到较高的能级，从而使分子处在激发态。此后，激发态分子通过内转换过程把部分能量转移给周围分子，使较高激发态的电子很快回到最低激发态的最低振动能级亦称第一单线态。处在第一单线态的分子的平均寿命是10-8秒左右

4、。如果这种分子通过发射出相应的光子而回到基态的各个不同的振动能级，即可产生荧光，根据回到的振动能级的不同，荧光的波长就不同，从而形成荧光发射带光谱。由于发射荧光前已有一部分能量被消耗，所以发射荧光所相应的能量要比物质吸收的光能量小，故而荧光的发射特征波长总比激发特征波长长。荧光光谱的相关概念1、激发光谱2、发射光谱3、荧光寿命和荧光量子产率4、荧光强度与溶液浓度的关系1、激发光谱 激发光谱是指引起荧光的激发辐射在不同波长的相对效率。把荧光样品放入光路之后，选择合适的发射波长与狭缝宽度，并使之固定不变，然后令激发单色器扫描，即可得到激发光谱。激发光谱的形状与选择的发射波长无关，但其相对强度与所选

5、择的发射波长有关。发射波长固定在它的峰位时，所得的激发光谱最大。2、发射光谱 与激发光谱密切相关的是发射光谱。它是由于分子吸收辐射后再发射的结果。把样品放入光路中后，选择合适的激发波长和狭缝，使之固定不变，然后扫描发射波长，即可得到发射光谱。 一般来说，发射光谱的形状与激发波长的形状无关。但当激发波长选在远离激发峰的地方，发射强度就小。除此之外，发射波长总是比激发波长要长，且发射光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。3、荧光寿命和荧光量子产率 荧光寿命和荧光量子产率是荧光物质的重要发光参数。荧光寿命定义为当激发光切断后荧光强度衰减至原强度的1/e所经历的时间。它表示了荧光分子的S1激发态的平均寿命。

6、=1/(kf+K) 式中：kf 表示荧光发射的速率常数； K代表各种分子内的非辐射衰变过程的速率常数的总和。 没有非辐射衰变过程存在的情况下，荧光分子的寿命称为内在寿命，用0 表示。 0 =1/kf 荧光强度的衰变，通常遵循以下方程式： lnI0-lnIt=t/ 式中：I0 和It分别表示t=0和t=t时刻的荧光强度。3、荧光寿命和荧光量子产率 荧光量子产率Yf定义为荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。 Yf=kf /(kf+ K) 可见荧光量子产率的大小取决与荧光发射过程与非辐射跃迁过程的竞争结果。 假如非辐射跃迁的速率远小与辐射跃迁的速率即Kkf ，那么Yf的

7、数值便接近于1。 通常情况下Yf 的数值总是小于1， Yf 的数值越大，化合物的荧光越强。荧光量子产率的大小，主要取决与化合物的结构与性质，同时也与化合物所处环境有关。3、荧光寿命和荧光量子产率 除常用的荧光量子产率外，在过去的论文或著作中也出现过“荧光的能量产率和“荧光的量子效率的术语。其分别表示荧光所发射的能量与所吸收的能量的比值以及处于发射荧光的激发电子态的分子百分数。 对这些概念应该有一定的了解。3、荧光寿命和荧光量子产率 有分析应用价值的荧光化合物，其荧光量子产率的数值一般通常处于0.11之间。 任何能影响激发态分子的光物理过程的速率常数的因素，都将使荧光的寿命和量子产率发生变化。如

8、：随着温度的升高，由于增大非跃迁过程的速率常数，从而使荧光的寿命和荧光量子产率下降。4、荧光强度与溶液浓度的关系 荧光既然是物质在吸光之后发射的辐射，因而溶液的荧光强度If应与该溶液吸收的光强度Ia及该物质的荧光量子产率Yf有关： If = Yf * Ia 而吸收的光强度等于入射的光强度减去统摄的光强度，于是可得： If = Yf *I0 It 从比尔-朗伯定律可知： It/ I0=e-abc ,因此 If = Yf *I01 e-abc 当abc很小时，e-abc 近似为1-abc，这时： If = Yf *I0*abc; 当用摩尔吸光系数代替a时： If = f *I0*bc4、荧光强度与

9、溶液浓度的关系由上式可知对与某种荧光物质的稀溶液，在一定的频率及强度的激发光照射下，当溶液的浓度足够小使得对激发光的吸收度很低时，所测溶液的荧光强度才与该荧光物质的浓度成正比。当时，那么荧光强度和溶液的浓度不成线性关系，此时应考虑二次方或三次方项的影响。4、荧光强度与溶液浓度的关系 随着溶液浓度的进一步增大，将会出现荧光浓度不仅不随溶液浓度线性增加，甚至随着浓度的增大而下降的现象，这是由于浓度效应而导致的。第一方面原因是内滤效应。当溶液浓度过高时，溶液中杂质对入射光的吸收作用增大，相当于降低了激发光的强度。另一个方面，浓度过高时，入射光被溶液池前部的荧光物质强烈吸收，处于中、后部的荧光物质，那

10、么因受到的入射光大大减弱而使荧光强度下降，而仪器的探测窗口通常是对准液池中部的，从而导致了所检测到的荧光强度的大大下降。其次，在较高浓度的溶液中，可能发生溶质间的相互作用，产生荧光物质的激发态分子与其基态分子的二聚物或与其他溶质分子的复合物，从而导致荧光光谱的改变和荧光强度的下降。如果荧光物质的发射光谱与其吸收光谱呈现重叠，就可能发生所发射的荧光被部分再吸收的现象导致荧光强度的下降。溶液的浓度加大时会促使再吸收的现象加剧。荧光光谱法蛋白质研究中的应用1.浓度测定2.构象变化研究3.相互作用研究注： Trp为色氨酸、Tyr为酪氨酸 以及Phe 为 苯丙氨酸蛋白质中的紫外吸收1.肽键在250 nm

11、的远紫外区有较大吸收2 .二硫键在250 nm附近有弱吸收3.色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸在280nm附近的吸收4 .蛋白质溶液中一些杂质的吸收蛋白质中含苯基侧链的氨基酸的紫外吸收光谱总结T rp、Tyr 以及Phe 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中T rp 的荧光强度最大, Tyr 次之, Phe 最小。因为蛋白质的荧光通常在280 nm 或更长的波长被激发,Phe 在绝大多数实验条件下不被激发, 所以很少能观察到Phe 的发射。这样蛋白质的内源荧光主要来自T rp 和Tyr 残基。T rp 残基对微环境的变化很敏感, 并且大多数蛋白质中都含有几个不同种类的T rp 残基, 而且在Trp存在的条件下，Tyr吸收的能量常常不是自己通过荧光发射释放出来，而是传递给Trp，由Trp发出荧光。因而常将Trp作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。对实验准确性的一些影响因子环境溶剂温度pH环境极性的影响光谱在极性溶剂中蓝移Tyr的吸收在极性溶剂中更加微弱溶剂的吸收温度荧光一般随温度上升而减弱，所以荧光实验需要恒温Tyr的吸收谱与pH有关没有考虑Tyr在蛋白质的外部还是内部与环境的极性有关主要