荧光分光光度法解析课件

1、第6章.荧光分光光度法6.1 概述6.2 方法原理6.3 荧光分析法6.4 荧光分光光度法在生物工程分析中的应用第6章.荧光分光光度法6.1 概述6.1 概述6.1 概述荧光蛋白质在2008年10月8日，诺贝尔奖委员会将化学奖授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发现和发展了绿色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein, GFP）”技术。 荧光蛋白质在2008年10月8日，诺贝尔奖委员会将化学奖授予用绿色荧光蛋白标记的细胞 用绿色荧

2、光蛋白标记的细胞 用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体(细胞、细胞器)的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。 用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体(细胞、细胞器)的标记荧光染料 能发出荧光的染料。在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。用于增白洗衣粉中的增白剂，指示信号用的各种荧光路标漆，荧光标志服等。 荧光染料 能发出荧光的染料。在吸收可见光和紫外光后，能把紫外荧光增白剂 它的特性是能激发入射光线产生荧光，使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的效应，使肉眼看到的物质很白，达到增白的效果。 其作用

3、是把制品吸收的不可见的紫外线辐射转变成紫蓝色的荧光辐射，与原有的黄光辐射互为补色成为白光，提高产品在日光下的白度。 荧光增白剂 它的特性是能激发入射光线产生荧光，使所染物质获得6.2 方法原理6.2.1荧光（磷光）产生机理6.2.2.1 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 。10/15/20226.2 方法原

4、理6.2.1荧光（磷光）产生机理10/11/2荧光F 磷光P 寿命10-7-10-9 S寿命10-4-10S荧光F 磷光P 寿命10-7-10-9 S寿命10-4-10单重态 所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。6.2.2.2 电子激发态的多重态单重态 6.2.2.2 电子激发态的多重态三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。荧光分光光度法解析课件S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转移振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转移l 2T2内转移振动弛豫10-14-10-1

5、2S10-13-10-11S10-2-10-4S10-4-10S10-9-10-7SS2S1S0T1吸发发系间窜跃内转移振动弛豫能l 2l 1l6.2.2.3 激发态基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间窜跃振动弛豫无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大。荧光：时间较短,第一激发单重态的最低振动能级基态。磷光：自旋禁阻，时间较长，第一激发三重态的最低振动能级基态。6.2.2.3 激发态基态的能量传递途径 电子处于激分子去活化过程及荧光的发生

6、 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-1110-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。分子去活化过程及荧光的发生 2. 内转移：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”。（“内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间）2. 内转移：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级3.荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫内转移振动驰豫到达第一单线激发态的最低

7、振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为 “荧光发射”。如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-9 10-7秒。（它代表荧光的寿命） 4.磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级(亚稳态)的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。荧光和磷光的根本区别: 荧光是由单重跃迁-单重引起的， 磷光则由三重跃迁-单重产生的。3.荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫内转移振动驰豫到6.2.2.4 分子荧光的类型分子因吸收光能而被激发，所产生的次级光发射现象称为光致发光；分子被激发的能量是由化学反应释放的能

8、量所提供，其发光现象称为化学发光。由生物体内化学反应所引起的发光现象，被称为生物发光。6.2.2.4 分子荧光的类型分子因吸收光能而被激发，所产生荧光棒荧光棒荧光棒内主要由过氧化物、酯类化合物和荧光染料三种化学成分构成。荧光棒发光原理是过氧化物和酯类化合物发生反应后，能量传递至荧光染料，再由染料发出荧光。荧光棒内主要由过氧化物、酯类化合物和荧光染料三种化学成分构成萤火虫、水母、深海鱼类发光机制是两种物质荧光素和荧光素酶合作产生的结果 萤火虫、水母、深海鱼类发光机制是两种物质荧光素和荧光素酶6.2.3 激发光谱与荧光光谱1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发

9、射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(I)，作I光谱图称激发光谱。2. 荧光光谱：选择ex作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录不同发射波长时的I，作 I- 光谱图称为荧光光谱。6.2.3 激发光谱与荧光光谱1. 激发光谱：将激发荧光的荧光分光光度法解析课件图68蒽在乙醇溶液中的镜像光谱图68蒽在乙醇溶液中的镜像光谱3.荧光光谱的特点：斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；荧光光谱与激发波长无关。无论用=250和350nm作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。3.荧光

10、光谱的特点：6.2.4 荧光量子产率与分子结构 1.产生并可观察到荧光的条件： i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）； ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。即量子效率 F足够大：6.2.4 荧光量子产率与分子结构 1.产生并可观察到荧光的2.分子结构与荧光的关系1）跃迁类型： 通常，具有*及n*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具*跃迁的荧光效率比 n*跃迁的要大得多。2）共轭效应： 共轭度越大，荧光越强。2.分子结构与荧光的关系1）跃迁类型：共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系分子结构与荧光3）刚性结构和共平面性： 分子刚

11、性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。 如荧光素（ 大）与酚酞（=0）分子结构与荧光3）刚性结构和共平面性：（3） 刚性平面结构酚酞(无荧光)8羟基喹啉(弱荧光)红色荧光CO-OOCOO-COCOO-ONO-NOMgNO荧光素（3） 刚性平面结构酚酞(无荧光)8羟基喹啉(弱荧光)红色联二苯 = 0.2芴 = 1.03,4-苯并芘( 强荧光物质)CH2联二苯 = 0.2芴 = 1.03,4-苯并芘( 强刚性结构和共平面性与荧光的关系8 羟基喹啉8 羟基喹啉镁刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系8 羟基喹啉8 羟基喹刚性结构

12、和共平面性与荧光的关系7 - 二甲胺萘 1 - 磺酸盐 F =0.758 - 二甲胺萘 1 - 磺酸盐 F =0.03空间位阻与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系7 - 二甲胺萘 1 - 分子结构与荧光4）取代效应： 给电子取代基增强荧光（p-共轭），如 -OH、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等； 吸电子基降低荧光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等； 分子结构与荧光4）取代效应：与体系作用小的取代基影响不明显： SO3R,NH3,SH,F,R。COOHNO2I无荧光NH2OH比荧光强50倍COOHNO2I无荧光NH2OH比荧光强50倍 取代基之间若发生氢键，增

13、强分子平面性和刚性会加强荧光:有荧光COOHOH无荧光OHCOOH水杨酸有荧光OHOHCO 重原子降低荧光但增强磷光， 如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光影响荧光的外界因素（一）溶剂效应： 溶剂极性可增加或降低荧光强度 （改变*及n* 跃迁的能量）； 与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。影响荧光的外界因素（一）溶剂效应： 影响荧光的外界因素（二）温度： 温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。如荧光素的乙醇溶液在0以下每降

14、低10 ，荧光效率增加3%，冷至-80时，荧光效率为100%。影响荧光的外界因素（二）温度：如荧光素的乙醇溶液在0以下每影响荧光的外界因素（三）pH值： 具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。影响荧光的外界因素（三）pH值：pH 13pH712苯胺苯胺在pH7-12溶液中会发生蓝色荧光，在pH小于2或大于13的溶液中都不发生荧光。pH 13pH712苯胺苯胺在pH7-12溶影响荧光的外界因素（四）内滤光和自吸： 体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长

15、有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。影响荧光的外界因素（四）内滤光和自吸：影响荧光的外界因素（五）荧光猝灭： 碰撞猝灭； 静态猝灭； 转入三重态的猝灭； 电子转移猝灭； 自猝灭。影响荧光的外界因素（五）荧光猝灭：例：猝灭剂（quencher）的影响荧光猝灭：是指荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。 引起荧光猝灭的物质，称为猝灭剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸电子极性物质。荧光猝灭法: 有些猝灭剂的加入，其荧光强度的减少与荧光猝灭

16、剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光猝灭法。例：猝灭剂（quencher）的影响荧光猝灭：是指荧光物质分溶液的荧光一荧光分析的定量基础荧光强度与溶液浓度的关系 F=F I0 Cb F 荧光效率 荧光物质的摩尔吸光系数 I0 激发光强度 b 液层厚度 F = KC（该式只有当 Cb 0.05时才成立）6.3荧光分析法溶液的荧光一荧光分析的定量基础荧光强度与溶液浓度的关系6.2. 荧光分光光度计2. 荧光分光光度计单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器。光源：高压汞灯、氙灯检测器：光电倍增管2. 荧光分光光度计单色器单色器光源。检测器液 槽放

17、大和指示仪表荧光分光光度计的结构示意图I0I单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧灯.滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中样品池用石英或低荧光的玻璃材料.激发光源发射单色器 用于选择投射到检测器的荧光波长。检测器 荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。精密的荧光光度计采用光电倍增管为检测器，将转入的光信号转变为电信号，并将其放大，由记录器记录荧光强度。发射单色器6.3.2 荧光分析方法特点及应用(一)荧光分析方法及特点1标准曲线法

18、用已知的标准物质经过和试样同样的处理后，配成一系列标液。测定标液的荧光强度，用荧光强度对标液浓度绘制标准曲线，然后根据试液的荧光强度，在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。6.3.2 荧光分析方法特点及应用(一)荧光分析方法及特点2荧光分析法的灵敏度 比吸光法高得多，更适合于低浓度物质的分子。 这两种方法在灵敏度方面的差别主要是由于同浓度相关的参数的测量方式不同。2荧光分析法的灵敏度 而荧光强度F（或磷光强度P）直接同荧光（磷光）物质的浓度成正比。同浓度相关的参数是在很小噪声背景上的荧光（磷光）发射讯号本身，可用增强入射光强度I0或增大荧光讯号的放大倍数来提高灵敏度。而在光度法中, 若检测器放

19、大倍数 ，I0及I同时,A值不变。 故荧光法灵敏度常比相应光度法高24个数量级。 而荧光强度F（或磷光强度P）直接同荧光（磷光） 在光度法中,表示方法的灵敏度。，其测定灵敏度。 在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的及发射时的量子效率有关。荧光法绝对灵敏度理论定义为的乘积（单位gcm-2 ）, ，荧光强度，测定灵敏度。荧光法绝对灵敏度实际定义为/H （H发射光谱半峰宽度m-1 ） 。 在光度法中,表示方法的灵敏度。，其测定 一般情况下，多采用相对灵敏度来表示。相对灵敏度是以喹啉硫酸氢盐的0.05mol/L硫酸溶液为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物质的荧光强度比较，可求该物质的相对灵敏度。 一般

20、情况下，多采用相对灵敏度来表示。相对灵敏度几种物质的荧光绝对灵敏度 荧光物质最大吸收波长/nm最大荧光波长/nm荧光光谱半宽度（H）m-1荧光灵敏度（最大吸收波长）喹啉硫酸氢盐(0.05molL-1H2SO4)2504610.470.066罗丹明B（酒精）5445710.170.88荧光素（0.1molL-1NaOH4905150.201.0四溴荧光素（0.1molL-1NaOH5185400.180.19硫堇(0.05molL-1H2SO4)5986210.180.031几种物质的荧光绝对灵敏度 荧光物质最大吸收波长最大荧光波长荧3. 荧光分析法的选择性 很多分子在紫外可见区有吸收，但其中只

21、有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法固有干扰很少，选择性较好。3. 荧光分析法的选择性1.无机化合物 很多金属（除铀盐等）和非金属可同有机化合物形成荧光配合物，测量发射的荧光可定量分析。荧光法可测元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sb、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn和Zr等。还有一些无机离子如氟和氰离子等能使其它物质的荧光由于熄灭效应而减弱。据此可测氟和氰等离子的浓度。 (二)荧光分析法的应用1.无机化合物 (二)荧光分析法的应用无机离子的荧光测定法 离子试剂波长，nm灵敏度干扰激发荧光g/mLAl

22、3+茜素紫酱R4705000.007Be,Co,Cr,Cu,Th,Zr,F-,NO2-,Ni,PO43-F-铝-茜素紫酱R(荧光熄灭)4705000.001Be,Co,Cr,Cu,Fe,Ni, Th,Zr, PO43-B4O72-安息香3704500.04Be,SbCd2+2-(邻羟基苯)苯并恶唑365蓝2NH3Li+8-羟基喹啉3705800.2MgSn4+黄酮醇4004700.1Fe,PO43-,ZrZn2+安息香绿10B,Be,Sb,无机离子的荧光测定法 离子试剂波长，nm灵敏度干扰激发荧光 2. 很多有机化合物可同无机阳离子形成荧光配合物，一般都具有苯环以及二个以上能同金属离子螯合的配

23、位基团。下面是四种最常用的荧光试剂的结构： 2. 很多有机化合物可同无机阳离子形成荧光配合物，一般都具 这些荧光试剂都具有电子系统。激发和发射过程同-*跃迁有关。这种跃迁常产生宽的无精细结构的荧光峰。 荧光分光光度法解析课件3.3.生物分子:利用激发光谱和发射光谱用荧光法研究氨基酸和蛋白质。虽然游离氨基酸中能产生荧光的只有几个带苯环的氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯基丙氨酸，然而，某些蛋白质含有荧光辅酶(Fluorescent coenzyme)，荧光辅酶生色剂可用于许多蛋白质的荧光分析中。 维生素B1(硫胺素)含量的测定 维生素B2(核黄素)含量的测定 维生素B11(叶酸)含量的测定3.3.生物分子:利用激发光谱和发射光谱用荧光法研究氨基酸和烟熏、烘烤、油炸等造成了3，4苯并芘含量的增加烟熏、烘烤、油炸等造成了3，4苯并芘含量的增加举例 痕量3,4-苯并芘的测定: 苯并芘方法一：萃取（环己酮或石油醚）浓缩层析以H2SO4 溶解苯并芘荧光分析荧光测定：ex = 520 nmem= 545 nm举例 痕量3,4-苯并芘的测定: 苯并芘方法一：荧光测定方法二：试样先用有机