实验一 3,5 -二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖

1、实验一 3, 5 -二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖1、实验目的：掌握还原糖和总糖测定的基本原理 掌握比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。2、实验原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 3、实验步骤：（一）葡萄糖标准曲线制作1. 取6个试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水 2. 向各试管中分别加入DNS试剂1 ml，充分混合，放入沸水浴中加热煮沸2 min

2、进行显色，取出试管放入盛有冷水的烧杯中迅速冷却。3.向各管中分别加入8 ml蒸馏水，充分混合。4.以空白管（0号管）做对照，于540nm 波长下调0，然后测定各管的OD值。5.以光吸收值作为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。如果该直线不通过零点，必须重做。 管号葡萄糖标准液（ml）蒸馏水（ml）最终浓度（mg/ml）OD540nm00.01.00.0010.20.80.20.332520.40.60.40.695530.60.40.61.009140.80.20.81.345751.00.01.01.6855（二）还原糖的制备1. 称取2g玉米粉，把它放入一个100ml的三角瓶中，然后

3、加入2030ml蒸馏水，搅拌均匀。2. 把三角瓶放于一个50水浴中保温 30 min，不时搅拌。3. 拿出三角瓶，将三角瓶内含物转入50ml的容量瓶中：过滤，定溶，充分混合，滤出液即为还原糖提取液。(三) 样品总糖的水解和提取1. 取1g玉米粉，放在100ml三角瓶中，加15ml水溶解，再加10ml 6mol/L 盐酸，混匀。2. 将三角瓶置于沸水浴中加热煮沸30 min。3.取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。 4.拿出三角瓶，冷却，过滤，滤出液即为总糖提取液。5.加入3-5滴酚酞指示剂，混匀，用6mol/L的NaOH中和至溶液呈微红色。将

4、中和后的溶液转入100 ml的容量瓶中定容。（四）样品中含糖量的测定1. 取5支试管，编号，按下表向每支试管中加入试剂。2. 用管1做对照，测定每管在540nm下的OD值。将结果记录在表中。试 剂管 号12345还原糖抽提液（ml）0.00.50.50.00.0总糖抽提液（ml）0.00.00.00.50.5DNS（ml）0.50.50.50.50.5加热在沸水浴中加热2分钟，然后冷却之。蒸馏水（ml）4.54.04.04.04.0OD54000.22710.22990.4723（稀释五倍）0.4983（稀释五倍）3. 根据还原糖和总糖的OD值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计算还原糖和总糖的百分

5、含量，即：还原糖= （从曲线中查出的还原糖的浓度N V/样品重）100%总糖= （从曲线中查出的总糖的浓度N V/样品重） 100% N：稀释倍数； V：提取液体积4、实验结果与讨论：问题1：3, 5-二硝基水杨酸（DNS）法测定时为什么要设空白对照？DNS本身有颜色，以第一管只含DNS的比色皿做空白对照可以排除DNS和比色皿本身含糖的干扰影响，通过比色法测定样品含糖量。问题2：费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法各有何优缺点？费林溶液与还原糖之间的反应受到溶液酸碱性、加热温度、搅拌力度、蒸发量、滴定速度以及副作用等参数影响，滴定终点的判断，人为影响因素较大，费林法测定更加不准确。而DNS法应用的分光光度计操作简单，测定准确，测试成本低，简化了测定程序，节约了试剂，同时也减少了滴定误差，避免了费林法中亚甲蓝的氧化问题，而且准确度和重现性也较好。问题3：何时用石英比色杯？何时用玻璃比色杯？为什么？在200-350n