本科生《P》5-第五章目的基因制备与克隆策略3-10课件

1、Princple and Technology of Genetic Engineering基因工程原理Professor, Dr. Degang Zhao (赵德刚)Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering, College of Life Sciences, Guizhou University E-mail: 1 第五章 基因工程工具酶 The Tool of the Gene Engineering 教学目的与要求：1）掌握II型限制性核酸内切酶的切割原理，和部分常用识别位点。2）掌握常作DNA聚合酶的特性和用途。3）了

2、解DNA连接酶和修饰酶在基因操作中的用途。2第一节 目的基因的制备 3目的基因（Target Gene）：指基因工程中需要进行制备、克隆或利用的基因。制备目的基因要根据需要获得DNA片段，可能是启动子、终止子、内含子，或者是编码某种蛋白完整的序列。目的基因制备方法有直接分离法、基因文库筛选法、PCR扩增法以及化学合成法等。一、目的基因的直接分离法1限制性核酸内切酶酶切分离法这是最简单的获取目的基因的方法，主要是从质粒、病毒等比较简单的DNA分子或基因组中分离目的基因。无论是已知序列或是尚未测序的序列都可进行分离，只要确定目的基因两侧的酶切位点，就可用相应的酶进行切割，获得目的基因。 42.基因

3、分离的物理化学法其原理是根据基因的DNA分子两条链GC含量差异较大，理化性质、包括浮力密度和解链温度明显不同所采用相应的方法进行分离。（1）密度梯度离心法 将DNA切割成适当片段，富含GC的双链DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速离心技术，可将DNA片段按不同密度大小分开。（2）单链酶解法 基因GC含量高（三个氢键），Tm值高，热稳定性高，可通过控制解链温度使富含A=T区变性解链， GC区维持双链状态，再利用单链核酸酶S1酶切单链部分，获得富含GC的基因片段。（3）分子杂交法 利用DNA单链易与互补链形成双链的原理，将已知基因DNA与目的生物的DNA进行复性，再用单链核酸酶S1酶切除单链，留

4、下的双链即为目的基因序列53.双抗体免疫法分离编码蛋白基因 基因翻译过程中，核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体。利用多肽链制备的抗体及二抗，与多聚核糖核蛋白体一起温育，目的基因的多聚核糖核蛋白体将通过抗原抗体反应与相应抗体形成复合物，利用不连续蔗糖梯度离心将此复合物分离出来，再通过酚/仿抽提法出去蛋白质部分，过oligo-dT柱层析，即可分离出特定蛋白编码的mRNA，反转录即可得到cDNA。目前，可用金黄色葡萄球菌中分离的protein A代替二抗，再用protein A-Sepharose 4B 作亲和层析，分离出特定的多聚核糖体（代替密度梯度离心）。 75构建基因文库分离

5、目的基因 基因文库分基因组文库和cDNA文库。基因文库可用质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒（cosmid）载体和酵母人工染色体（YAC）载体进行构建。从基因组文库可以分离获得基因编码序列、调控序列、启动子、终止子、核糖体识别mRNA序列、ARS、端粒序列、间隔序列等，可用于基因结构分析、基因表达和调控研究等。 cDNA文库来自于模板mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表达的转录及加工后mRNA产物所携带的信息，所以从cDNA文库可以分离到基因的编码序列。8筛选基因文库的方法： 已知基因序列，可以人工合成核酸探针，通过核酸杂交，从基因文库中筛选出含目的基因的克隆。 已分离纯化某蛋白，并知其氨基酸序列

6、，根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作为探针，筛选基因文库。 已纯化某蛋白，未能测出其氨基酸序列，可以该蛋白制备抗体，从cDNA表达文库中筛选出含该蛋白编码基因的克隆。 对编码产物未知的基因，采用特殊分离方法如差别显示技术、差减杂交法、遗传互补法等。10核酸杂交法（同源序列克隆法）：（1) 原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因。（2) 核酸探针种类 DNA探针: 分离自某一种生物。 寡核苷酸探针: 根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测，人工化学合成。如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala 六肽 QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN 对

7、应mRNA N：ACGT/U CAN-AAP-GTP-CTP-CG 探针序列 Q：CT/U P：AG32种14聚体的混合物，其中必有一种与待测DNA完全互补。cDNA探针: 利用特异性 mRNA反转录而成，亦可用不同mRNA 混合物反转录而成。RNA探针: 由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得。11分离步骤：基因文库 制备DNA样品膜与标记探针杂交 杂交斑点（阳性克隆）分离重组DNA分子 作斑点和Southern杂交以确认杂交结果 DNA进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物。6特异性DNA片段(基因)的

8、PCR扩增 124目的基因的化学合成法（1）核酸片段化学合成 有磷酸二酯法、磷酸三酯法和亚磷酸三酯法，反应体系有液相和固相。目前常用的方法是固相亚磷酸三酯法。第一个核苷酸的3端通过3羟基与惰性固相载体上的间隔臂形成酯健，寡核苷酸按3-5方向进行化学合成，正常终产物是3、5端均带有羟基的寡聚核苷酸。合成原料：经化学修饰的核苷亚磷酰胺。有两种类型： 甲基化亚磷酰胺； -氰乙基-亚磷酰胺。合成时要对羟基、磷酸、氨基进行保护，合成结束后，去掉所有保护基团。固相载体：是对DNA合成试剂惰性的物质，目前采用可控孔径的玻璃沙（CPG）,其表面的硅氧烷键可与A、G、C、T核苷的3-羟基以酯键连接，该键可用29

9、%浓氨水打断。14（2）化学合成DNA片段种类 DNA互补链合成引物 包括PCR引物和测序引物。 DNA Linker 预先设计，通过化学合成的寡聚核苷酸片段，含有1种或几种酶切位点，酶切可产生粘性末端。如果将含有多个酶切位点的Linker 引入克隆载体中，就会形成多克隆位点（MCS），这种具有多克隆位点的连杆称MCS Linker。 Adaptor 是一种化学合成的寡聚核苷酸，含有一种以上的内切酶位点。其与Linker的差别是Adaptor一端或两端已有1种或两种内切酶切割产生的粘性末端。 DNA 芯片指DNA片段以事先设计的排列方式固定在载波片或尼龙膜上组成的密集分子排列。固定的是探针，或

10、者是靶DNA分子。15（3）目的基因的化学合成法1979年，Khorana等首次化学合成基因有生物活性。有全片段酶促连接法和酶促填充法。17（2）计算机克隆(silicon cloning)或生物信息学(bioinformatics)克隆新基因策略生物信息学克隆新基因策略是表达序列标签法的延伸和发展。生物信息学与计算机科学、信息学等学科相互交叉而诞生的一门新兴学科，核心内容是通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而达到揭示数据所蕴含的生物学意义的目的。做法：利用已发现的其他物种基因的cDNA序列为参照，在国际互联网的EST数据库（GebBank或EMBL等）中进行同源搜索，获得

11、一系列同源的或部分重叠的EST 序列，然后用GCG、DNAstar 软件中的alignment 程序将它们拼接成一个EST 重叠群(contig)，经过逐步延伸（cDNA salking)及整合后可获得全长的cDNA 序列；根据该推测的序列，可合成相应的特异引物，进行PCR 扩增后，即可获得该基因的cDNA片断。局限性：难以寻找到一些表达量极低或者不表达的新基因类型，克隆基因的功能也有待鉴定。18（3）基因表达系列分析法基因表达系列分析法(serial analysis of gene expression,简称SAGE)可一次对大量基因转录产物进行定量分析，从中找出新的基因。原理（两个）：

12、从转录物某一特定位置上分离得到一段910bp 的寡核苷酸序列标签(sequence tag, ST)，它含有确定的一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录物的特异性。理论上随机排列的9bp片断可区分262 144（4 9）种转录物，人类的基因约仅有80 000个转录子，因此，9个核苷酸序列可以代表所有转录子的特征。 多个序列标签（ST）能以锚定酶 (anchoring enzyme, AE，识别位点为4碱基的限制性核酸内切酶)识别位点序列相隔相互连成双标签序列(ditag)的多联体，将该多联体序列克隆到一个载体中，用连续的方法进行多联体序列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（ST）代表转录

13、产物的种类和出现频率，由此实现对转录物的高效、快速和大量的分析。19 6筛选目的基因片断的差别杂交及减法杂交技术（1）差别杂交法差别杂交（differential hybridization）或称为差别筛选(differential screening)法，特别适用于分离在特定组织中、发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。方法是分别制备两种不同细胞群体的mRNA 提取物，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRNA，另一个群体不含有目的基因mRNA。以这两种总mRNA（或是它们的cDNA 拷贝）为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构件的c

14、DNA文库进行筛选。 20（2）减法杂交技术 减法杂交（subtractive hybridization）又叫做差减杂交克隆、扣除杂交、减数杂交或消减杂交等，该技术是通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库(subtractive library)的方式来进行目的基因克隆。减法杂交的对象可以是DNA，也可以是 cDNA，相应地称为基因组 DNA减法杂交和mRNA减法杂交。后者分析差异表达的基因，适于某些低丰度mRNA的 cDNA克隆。mRNA减法杂交原理：从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取mRNA做过量杂交，在两种组织中

15、均表达的基因产物形成cDNA/mRNA 双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。 21（3）基因表达系列分析法基因表达系列分析法(serial analysis of gene expression,简称SAGE)可一次对大量基因转录产物进行定量分析，从中找出新的基因。原理（两个）： 从转录物某一特定位置上分离得到一段910bp 的寡核苷酸序列标签(sequence tag, ST)，它含有确定的一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录物的特异性。理论上随机排列的9bp片断可区分262 144（4 9）种转录物，人类的基因约

16、仅有80 000个转录子，因此，9个核苷酸序列可以代表所有转录子的特征。 多个序列标签（ST）能以锚定酶 (anchoring enzyme, AE，识别位点为4碱基的限制性核酸内切酶)识别位点序列相隔相互连成双标签序列(ditag)的多联体，将该多联体序列克隆到一个载体中，用连续的方法进行多联体序列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（ST）代表转录产物的种类和出现频率，由此实现对转录物的高效、快速和大量的分析。第二节 目的基因克隆没有任何一种克隆方法能够涵盖所有好处，克隆步骤：1）克隆一个基因的方法：cDNA 合成 限制性核酸内切酶消化 机械剪切 Mechanical shearing2

17、）加到载体上：选择寄主和载体系统平末端连接 Blunt-end ligation使用连接头 Use of linker molecules粘性末端连接 Ligation of cohesive termini同聚物尾巴 Homopolymer tailing3）Introducing the recombinant DNA into a host cell：重组质粒转化 Transformation with recombinant plasmid DNA重组噬菌体DNA转染 Transfection with recombinant phage DNADNA体外包装 Packaging DN

18、A in vitrocDNAsynthesisRestriction enzyme digestion Mechanicalshearing DirectChemicalsymthesisPackagingDNA in vitroTransformation withRecombinantPlasmid DNATranfection with RecombinantPhage DNABlunt-endligationUse of linkermoleculesHomopolyertailingLigation of CohesiveterminiGeneration of gene fragm

19、entChoose the host/vector systemIntroducing the recombinant DNA into a host cellChapter 6看家基因（Housekeeping genes）：又称管家基因或持家基因：在所有细胞中均要表达的一类基因，其产物对维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少（for basic cellular metabolism），表达水平受环境因素影响较小，在各生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基

20、因等Housekeeping genes: for basic cellular metabolism每一个细胞都会生产大量的特殊的mRNA Poly(A)+RNA: each cell type produce different abundance classes of particular mRNAs.一、Cloning from mRNAChapter 6mRNAA A A A A A-35Chapter 6RTaseHO-T T T T T T-5A A A A A A-3 T T T T T T-3 T T T T T T-3NaOHOHss cDNADNA polymeraseK

21、lenow fragment T T T T T T-3S1 nucleaseds cDNASynthesis of cDNAmRNAA A A A A A C C C C -35T T T T T T-5T T T T T T -5Alkaline sucrosegradientds cDNAA A A A A A-35T T T T T T-5cDNA3CTerminal transferase+dCTP3-C C C C C CRTaseT T T T T T -53-C C C C C C5-G G G G G GAdd oligo(dG)primerChapter 6Oligo （d

22、G）-primed second-strand cDNA synthesis CCCC3-C blunt-end ligation: S1 nuclease destroy the protruding ends of DNA; DNA polymerase (klenow fragment) filling the protruding ends of DNA.Main disadvantage: 1) is an inefficient process, require high concentration DNA for ligation; 2) vector self-ligate t

23、o produce circular molecules or the insert/vector DNAs may form concatemers instead of bimolecular recombinants, use phoshpatase (either BAP or CIP) to prevent self-ligation; 3) cloning site disappear in the recombinant DNA2 Cloning cDNA in plasmid vectorsTwo methods: 1) Ligation of blunt-end 2) Lig

24、ation of cohesive termini a. Use of linker moleculesb. Homopolymer tailingCCGAATTCGGGGCTTAAGCCLinkers: are self-complementary oligomers that contain a recognition sequence for a particular restriction enzyme.DNA ligaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCC5-AATTCGG GCCCCGGGCTTAA-5EcoR IAdaptors: a

25、re single-stranded non-complementary oligomers that may be used in conjunction with linkers, when annealed together and be added to the cDNA to provide sticky-end cloning without digestion of the linkers.OH-GATCCCCGGGDNA ligaseCCCGGGGGGCCCCTAG-OH- 5GGGCCCGGATCCCCTAGGBamH I+OH-GATCCCCGGG GGGCCC5-OH-G

26、ATCCCCGGG GGGCCCCCCGGGGGGCCCHpaIIHomopolymer tailing: the enzyme terminal transferase is used to add homopolymers of dA, dT, dG or dC to a DNA molecule.Pst IvectorCCCCCCCC-33-CCCCCCCCInsertCTGCAGGGGGGGG-3G3-GGGGGGGGACGTCGPst I siteGGGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGGGGACGT TGCAGCCCCCCCCCCCCCCCCPst I siteEnzyme

27、 digestionTerminal transferase + dCPst I digestionTerminal transferase + dGDNA ligaseTarget geneMain advantage: 1) packaging in vitro may generate the recombinant phage, which increases the efficiency of the cloning process. 2) much easier to store and handle large numbers of phage clones than plasm

28、ids.3 Cloning cDNA in bacteriophage vectorsIf a large number of recombinants was required, and a low-abundance mRNA was to be cloned,phage vectors may be more suitable.Cloning cDNA in vectors using linkers:EcoR I methylaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCAdd EcoR I linkersds cDNAMeMeCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCG

29、GGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCDigest with EcoR ILigateInsertvectorvectorLA vectorRAgenomic library: is often used to describe a set of clones representing the entire genome of an organism.To determine the intronsTo examine the control sequ

30、ences responsible for regulating gene expression二、 Cloning from genomic DNA1 Genomic librariesaim of constructing a genomic library is for isolating a target DNA sequence. Clone bank ( library ):A collection of independent clones is termed a clone bank or library估计基因组文库大小的经验（empirical formula）公式： N=

31、ln(1-P)/ln(1-a/b)N: the number of clones requiredP: desired probability of a particular sequence being represented(0.95 or 0.99)a: the average size of the DNA fragment to be clonedb: the size of the genome organismGenomeSize(kb)No.clones N,P=0.9520kb inserts45kb insertsEscherichia coli(bacteria)4.01

32、036.01032.7103Saccharomyces cerevisiae (yeast)1.41042.11039.3102Arabidopsis thaliana(simple plant)7.01041.11044.7103Drosophila melanogaster (fruit fly)1.71052.51041.1104Stroglyocentrotus purpuratus (sea urchin)8.61051.31055.7104Homo sapiens(human)3.01064.51052.0105Triticum aestivum(hexaploid wheat)1

33、.71072.51061.1106Genetic library sizes for various organisms选择哪种载体用于基因组文库构建？ Which vector is used to choose for construction of genetic library? phage vector：有效容纳量是15kbcosmid vector：有效容纳量是45kb建立基因组文库的一般程序：1载体DNA片段的制备载体DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应3. 供体与载体DNA连接 提高重组频率，应注意连接反应体系中总DNA浓度和两种DNA分子的摩尔数比率。2 供体DNA片段的制

34、备 机械剪切法总DNA分离纯化 分离特定大小DNA片段 酶法 （部分酶切、完全酶切 ）4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增 利用转化或感染方法将连接好的重组DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）。5. 基因组文库质量的评价 1）文库规模-随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。 2）重组频率-频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。Cloning DNA in vectors using linkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTA

35、AGCCInsertvectorvectorCloning DNA in vectors using linkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvectorThe molecular weight of the DNA after isolation from the organism. The method used to fragment the DNA.文库的连接、包装和扩增Two main consideration when preparing DNA fragment for cloning:For a

36、completely random library, DNA molecular weight should be very high. 100kb is available. Fragmentation can be achieved either by mechanical shearing or by partial digestion with a restriction enzyme.CTAGAnnealBamH I Sau3 AGCCTAGGATCC GGATC CTAGGATC GCCTAGGATC CTAGGATCC GCloning Sau3A fragments into

37、BamH I site5-GGATCC-33-CCTAGG-5BamH I 5-NGATCN-33-NCTAGN-5Sau3 AE B SE B SEMBL 4Left armRight armS SLeft armRight armS/BS/BGATCCTAGGATCCTAGLigation of Sau3A cut DNA into the replacement vector EMBL45-GGATCC-33-CCTAGG-5BamH I 5-NGATCN-33-NCTAGN-5Sau3 AEMBL4 GATCCTAG GATC CTAGE B SE B SLeft armRight a

38、rmStuffer fragmentS SLeft armS/BGATCCTAGGATCCTAGS/BRight armInsert DNASau3A cohesive endSau3A cohesive endLigation of Sau3A-cut DNA into thereplacement vector EMBL4GATCCTAGGATCCTAGcoscosInsertInsertInsertcoscosLALALARARAPackaged in vitroConcatemeric recombinant DNAPrimary libraryAmplification of lib

39、raryPlating the packaged phage on a suitable host of E. coli, then resuspending the plaques by washing the plates with a buffer solutionConcatemeric recombinant DNA and amplification of library 4. 更先进的克隆技术Advanced cloning strategies1) Synthesis and cloning of cDNAOkayamaBerg法 1）T引物的合成：在质粒上进行，用于合成第一条

40、cDNA链 2）G引物的合成：在质粒上进行，用于合成第二条cDNA链 3）第一条cDNA链合成：T引物与mRNA退火 反转录反应 4）第二条cDNA链的合成： a.第一条cDNA链3-末端加尾（dCTP） b.限制酶切除去 载体上所加的多聚C尾巴 c. 与G引物退火 d.除去RNA e.合成第二条cDNA链 5）cDNA文库的形成转化 2) Expression of cloned DNA moleculesPromoter（启动子）: are regions with a specific base sequence, to which RNA polymerase will bind.St

41、rong promoter: 强启动子Weak promoter: 弱启动子Inducible promoter: 诱导型启动子在原核生物中（In prokaryotic promoter）：Consensus sequence: In prokaryotic promoter, two main regions is important:-10 region= Pribnow box: 5-TATAAT-3-35 region: 5TTGACA-3真核生物中（In eukaryotic promoter）:Enhancers（增强子）: may be located hundreds or

42、thousands of base-pairs upstream from the Tc start site. -25 position：CAAT box.Around -25 position with the consensus sequence 5-TATAAAT-3 (the TATA or Hogness box) and a sequence in the -75 region with the consensus 5-GG(T/C)CAATCT-3, known as the CAAT box.EcoR ISac IPst IHind III1）SacI2）TdT+dTTPEc

43、oR ISac ITTTTTHind IIITTTTTAAAAAmRNAAMV-RT+dNTPTTTTTTTTTTAAAAATdT+dCTPTTTTTAAAAATTTTTCCCCEcoR I SacIPst IHind IIICCCC1）HindIII2）取大片段TTTTTCCCCSac IHind IIIPst I1)PstI 2)TdT+dGTPEcoR IGGGGHind IIIGGGGPst ISac I1）HindIII2）取小片段Hind IIIGGGGBAC: bacterial artificial chromosomesYAC: yeast artificial chromosomesCloning large DNA fragments in BAC and YACTELT