食品质量检测技术-肠道致病菌的检验与鉴定

第七章肠道致病菌的检验与鉴定食品质量检测技术第一节概述一、食品品中常见见的肠道道致病菌菌沙门氏菌菌志贺氏菌菌大肠艾希希氏菌变形杆菌菌耶尔森菌菌二、生物物学特性性1、形态与与染色均为革兰兰氏阴性性杆菌，，中等大大小，无无芽胞，，多数具具有周身身鞭毛能能运动，，志贺氏氏菌属无无鞭毛无无动力。。2、培养和和生化反反应（1）、需氧氧或兼性性厌氧，，菌落中中等大小小，表面面光滑，，液体培培养基混混浊生长长。（2）、肠道道致病菌菌一般不不分解乳乳糖，而而非致病病菌多能能分解乳乳糖、葡葡萄糖产产酸或产产酸产气气。（3）、可还还原硝酸酸盐为亚亚硝酸盐盐。三、抗原原类型O抗原也称菌体抗原，细胞壁脂肪糖，耐热100℃不被破坏H抗原也称鞭毛抗原，鞭毛蛋白，不耐热，60℃30′可破坏K抗原也称表面抗原（荚膜抗原），多糖，具有阻抑O抗原发生凝集的现象，加热60℃30′可消除抑阻作用菌毛抗原也称菌毛蛋白抗原

,不耐热,干扰O凝集

四、致病性（一）、、致病物物质1、内毒素素：能引引起机体体发热，，白细胞胞减少，，低血糖糖，血压压降低，，严重者者休克。。2、外毒素素：对小肠肠粘膜细细胞具有有物殊毒毒害作用用，引起起腹泻。。（二）、、所致病病疾1、伤寒寒和副伤伤寒2、食物物中毒3、细菌菌性痢疾疾五、微生生物检验验的基本本程序检样→处处理→增增菌培养养→分离离培养→→生化试试验→血血清学鉴鉴定→报报告思考题1、肠道道致病菌菌具有哪哪些生物物学特性性?2、肠道道致病菌菌具有哪哪些抗原原？又称称为什么么？有什么特点点？3、写出出肠道致致病菌检检验的基基本程序序

第二节、、沙门氏氏菌检验验一、概况况（一）沙沙门氏菌菌的发现现与食物物中毒（二）沙沙门氏菌菌的命名名根据所致致疾病命命名根据菌的的发现地地区命名名以发现者者的名字字命名（三）沙沙门氏菌菌的抵抗抗力60℃30′可杀死死（四）沙沙门氏菌菌的分类类地位及及定义1、地位：：是肠杆杆菌科、、埃希氏氏菌族、、沙门氏氏菌属中中的细菌菌2、定义是肠杆菌菌科中形形态和培培养特征征，生化化反应及及抗原结结构相似似，被O1噬菌体裂裂解的一一群革兰兰氏阴性性杆菌。。二、生物物学特性性（一）、、形态与与染色：：革兰氏染染色阴性性，无荚荚膜，无无芽胞，，多数有有鞭毛，，有动力力，短小小杆菌。。（二）、、培养特特性1、需氧或或兼性厌厌氧，最最适温度度37℃，PH7..2~7.4。(沙门氏菌菌（红色色）侵入入人体细细胞2、对营营养要求求不高，，在普通通培养基基生长良良好，37℃℃，24h，能能形成菌菌落中等等大小，，直径2～3mm，圆圆形或卵卵形，表表面光滑滑湿润，，无色半半透明，，边缘整整齐的菌菌落3、在液液体培养养基中，，呈均匀匀混浊性性生长，，无菌膜膜。

（三）、、生化特特性1、发酵酵GLU，甘露露醇，山山梨醇产产酸产气气（伤寒寒鸡伤寒寒沙门氏氏菌少数数不产气气）2、不发发酵乳糖糖，蔗糖糖，侧金金黄花醇醇3、多数数产生H2S（（+），，不产靛靛基质（（-），，不分解解尿素（（-），，不产生生乙酰甲甲基甲醇醇（V——P）（（-），，4、能还还原硝酸酸盐为亚亚硝酸盐盐（+））5、在KCN培培养基中中生长（（-），，苯丙氨氨酸脱氨氨酸（--）（四）、、抗原结结构主要两种种：A、O抗抗原B、H抗抗原C、表面面抗原（（K抗原原）D、菌毛毛抗原2、O抗原（1）O抗原原的表示示方法共有58种，用用字母O和阿拉拉伯数字字标记：：O1、、O2、O3、O4如：伤寒杆菌菌：O9、、O12（2）沙沙门氏菌菌的分群群及表示示方法

用大写字字母及相相关符号号表示：：A、B、、C、D、E、、F………Z、、O51~~O63、O65~~O67

（3）沙沙门氏菌菌中的主主要菌群群及其群群特异性性抗原A群-----O2B群-----O4C群-----O6C1群------O7、、C2群------O6O8、C3群------O8、、C4群------O6O7O14D群-----O9F群-----O11E群-----O3E2群------O3、、O10族E3群------O3、、O15E4群------O1、、O3、O193、H抗原（鞭鞭毛抗原原）耐热性差差：60℃15′或酒精处处理可破破坏

沙门氏H抗原有两两种：第1相：特异异相，用用英文小小写字母母表示a、b、c……zz1~z55第2相：非特异异相，用用阿拉伯伯数字表表示1、2、3……其中也有有用小写写字母a、n、x等表示。。4、表面面抗原：：沙门氏菌菌K抗原有三三种：Vi、M、5抗原、

Vi抗原位于于菌体的的最表层层，包围围了O抗原，可可阻碍O抗原的血血清学凝凝集试验验。破坏坏Vi抗原：60℃30′，100℃5′含有Vi抗原原的沙门氏菌：伤寒沙门门氏菌、、丙型副副伤寒沙沙门氏菌菌、都柏柏林沙门门氏菌三、沙门门氏菌食食物中毒毒（一）、引引起食物物中毒最最常见的的沙门氏氏菌：鼠伤寒沙沙门氏菌菌、肠炎炎沙门氏氏菌、猪猪霍乱沙沙门氏菌菌

（二）、、易引起起沙门氏氏菌中毒毒的食品品肉、蛋、、乳类食食品行业关注注：美国国两种花花生酱含含沙门氏氏菌(三)、中毒原原因1、食用病病畜禽的的肉制品品食品2、病畜禽禽、带菌菌人和动动物使食食品受污污染3、用不洁洁净水外外理食品品（四）、、临床病病状（所所致病菌菌）1、肠热病病：伤寒寒与副伤伤寒病，，为慢性性发热的的菌血病病。由伤寒与与副伤寒寒菌引起起，潜伏伏期7~20天2、急性肠肠胃类：：主要症症状：头头痛、发发热、恶恶心、呕呕吐、腹腹泻、出出冷汗、、及全身身不适，，病程2~3天3、败血病病：高烧、、寒战、、厌食、、局部发发炎、由由猪霍乱乱沙门氏氏菌等引引起四、微生生物检验验（一）、、基本步步骤（程程序）检样→增增菌（前前增菌））→分离离培养→→生化试验初步步鉴定→→血清学学反应最最后鉴定定→报告告

1、前增增菌：用用无选择择性的培培养基使使处于濒濒死状态态的M恢恢复活力力;2、选择择性增菌菌：使沙沙门氏菌菌优势繁繁殖，基基它细菌菌变到抑抑制;3、选择择性平板板分离培培养：分分离出所所需的细细菌;4、生化化试验：：鉴定分分离出来来的细菌菌是否符符合所检检项目的的细菌;;5、血清清学鉴定定：进一一步鉴定定。（二）、、检验操操作关键键点1、增菌：：使待检检菌复壮壮，抑制制杂菌生生长，提提高检出出率。

前增菌：：用于加加工过的的食品，，37℃，4~8h或18~24h，长有杂杂菌。增菌培养养基：增增菌液一一般用MM和SC两种，如如可能是是伤寒沙沙门氏菌菌用TTB，用42℃培养。2、平板分分离选择性培培养基：：BS、DHL、HE、WS、SSBS中最好，，DHL、HE、WS很好，SS最差一般要用用：BS和WS/SS两个平板板，BS主要用于于伤寒沙沙门氏菌菌的分离离BS上的菌落落DHL上的菌落落SS上的菌落落3、五项生生化试验验H2S、靛基基质、PH7..2尿素酶、、KCN、赖氨酸脱脱羧酶（1）三糖铁铁培养的的培养典型沙门门氏菌在在三糖铁铁培养上上的特征征：表面（-）粉红色色、底层层（+）黄色、、H2S（+）底层有有黑色、、有动力力。在TSI培养基中中：表面（（+）黄色、、H2S（-）的培养养物可排除，其它培培养物均均有可能能是沙门门氏菌。。（2）其余四四项生化化实验靛基质PH7..2尿素酶KCN赖氨酸脱脱羧酶反应序号号：A1、A2多见，B1少见（3）、典型型沙门氏氏菌的五五项生化化反应及及其检验验的利用用A、典型五五项生化化反应：：A1H2S（+）靛基质（（-）PH7..2尿素酶（（-）KCN（-）赖氨酸脱脱羧E（+）

B、利用五五项生化化反应鉴鉴定沙门门氏菌的的最简单单方案a、对于H2S阳性菌，，利用五五项生化化反应试试验可判判别沙门门氏菌和和柠檬酸酸杆菌。。b、对于H2S阴性菌，，查到B1时即：H2S（-）靛基质（（-）PH7..2尿素酶（（-）KCN（-）赖氨酸脱脱羧E（+），补做做ONPE试验，可可判定沙沙门氏菌菌属和埃埃希氏菌菌属（ONPE（-）为沙门门氏菌，，ONPE（+）大肠艾艾希氏菌菌5、血清学学试验（（最后鉴鉴定）（1）、沙门门氏菌诊诊断血清清的种类类：10种组合血血清：主主要用于于伤寒和和副伤寒寒沙门氏氏菌鉴定定26种组合血血清：常常见致病病菌的定定群与分分型57种组合血血清：常常见定型型，初步步鉴定A—F群以外的的菌型144种组合血血清：全套装装（2）、血清学学检验步步骤抗原准备备→→A—F多价血清清检验（（判定是是否是沙沙门氏菌菌）→→群特异性性抗体血血清（如如O2、O4、O3、O7、O8、O9、O10、O11（判定O群别）→→O单因子血血清检查查→→H因子血清清检查（（分型））→→报告五、检验验结果的的报告1、凡血清清学鉴定定与生化化反应均均符合者者，报告告发现沙沙门氏菌菌。经检验，，××××食品发发现有沙沙门氏菌菌2、凡血清清学鉴定定与生化化反应均均不符合合者，报报告未发发现沙门门氏菌。。思考题：：1、典型沙沙门氏菌菌的五项项生化试试验结果果如何？？2、沙门氏氏菌的形形态特征征，培养养特性是是什么？？3、沙门氏氏菌检验验时为什什么要进进行前增增菌和增增菌？4、沙门氏氏菌有哪哪些抗原原？各有有何特点点？O、H抗原如何何表示，，A—F群沙门氏氏菌中，，代表每每群O特异性抗抗原的独独特因子子是什么么？5、沙门门氏菌哪哪几个菌菌型具有有Vi抗抗原，Vi抗原原对O抗抗原血清清涟试验验有何影影响，对对含Vi抗原菌菌，如何何做O抗抗原血清清学试验验。6、沙门门氏菌在在SS平平板，TSI培培养基上上生长的的现象如如何，说说明其原原理。7、分离离纯化后后怎样选选用最少少的生化化试验方方法初步步鉴定检检验菌是是否是沙沙门氏菌菌属的细细菌。8、如何何进行沙沙门氏菌菌的血清清学试验验。第三节、、志贺氏氏菌的检检验一、生物物学特性性（一）、、形态与与染色革兰氏阴阴性短杆杆菌、无无荚膜，，无芽胞胞，无鞭鞭毛2~3um*0.5~~0.7um（二）、、培养特特性1、需氧或或兼氧性性厌氧，，最适温温度37℃，PH7..2~7.42、在普通通琼脂和和SS平板上，，能形成成圆形、、微凸、、光滑湿湿润、无无色半透透明、边边缘整齐齐、在中中等大小小的菌落落3、宋氏志志贺氏菌菌菌落较较大，较较不透明明，粗糙糙而扁平平，在SS平板上可可迟发酵酵乳糖，，菌落呈呈玫瑰红红色。4、在肉汤汤中呈均均匀混浊浊生长，，无菌膜膜。（三）、、生化反反应1、发酵葡葡萄糖，，产酸不不产气，，除宋氏氏志贺氏氏菌外，，均不发发酵乳糖糖。2、不发酵酵侧金盏盏花醇、、肌醇、、水杨苷苷。3、不产生生H2S，不分解解尿素，，V-P试验阴性性，不能能利用柠柠檬酸盐盐。4、甲基红红阳性。。（四）、、抗原结结构1、抗原构构成：O抗原：群特异性性抗原：：A、B、C、DK抗原：除除B群外，一一般有K抗原

2、志贺氏氏菌的分分群与血血清型志贺氏菌菌分为四四群：A群（痢疾疾志贺氏氏菌）：：1~10型B群（福氏氏志贺氏氏菌）：：1~6型+X、Y两个变种种，C群（鲍氏氏志贺氏氏菌）：1~15型D群（宋内内氏志贺贺氏菌））：1个型志贺氏菌菌属抗原原的分类类菌名

血清分类生化特性群型亚型甘露醇鸟氨酸脱羧酶志贺氏菌A1～10

－-福氏菌B1～6x、y变种1a、1b、2a、2b、3a、3b3c、4a、4b+-鲍氏菌C1～15

+-宋内氏菌D1

+＋葡萄糖+乳糖-甘露醇-痢疾志贺贺氏菌1、3、、4、5、、6、9、10型痢疾志贺贺氏菌2、7、、8型福氏6型，鲍氏氏1、2、3、4、、5、6、8、、10、、12、、14型型福氏痢疾疾菌（1、2、3、4、、5型）鲍鲍氏5、、7、9、11、13、15型靛基质-乳糖+宋氏志贺贺氏菌靛基质-靛基质+靛基质-靛基质+甘露醇+3、属内外外抗原关关系（1）群内抗抗原关系系：A群：2与10型，具有有密切关关系C群：1与4和11型，10与11相关B群：群抗抗原是B群各型之之间的共共同抗原原（2）群间抗抗原关系系：C群17型与A群3型相关C群18型与A群11型相关

（3）属属外抗原原关系：：志贺氏菌菌与艾希希氏菌属属的O抗抗原关系系非常密密切，除除A群9型和D群宋氏氏菌与埃埃氏希菌菌的O抗抗原关系系未见报报道外，，每一个个型都与与一定的的艾希氏氏菌的O抗原有有关。

4、K抗抗原对O抗原血血清学试试验的影影响

可阻碍O抗原的的血清学学凝集试试验，煮煮沸处理理即可。。（五）志志贺氏菌菌的抵抗抗力志贺氏菌菌属在外外界环境境中的生生存力，，以宋内内氏最强强，福氏氏菌次之之，志贺贺氏菌最最弱。一般在潮潮湿土壤壤中能存存活34天，37℃水中存存活20天，在粪粪便内（（室温））存活11天。日光光直接照照射30分钟，56-60℃10分即被杀杀死，对对高温和和化学消消毒剂很很敏感，，1%石炭酸中中15-30分钟即被被杀死，，对氯霉霉素、磺磺胺类、、链霉素素敏感，，但易产产生耐药药性。

二、志贺贺氏菌的的致病性性与食物物中毒（一）流流行病学学传染源食物、病病人、粪粪便、苍苍蝇等（二）志志贺氏菌菌的致病病性致病因素素：侵袭力、、菌体内内毒素、、外毒素素（二）临临床症状状A、急性细细菌性痢痢疾：急性典型型、急性性非典型型、急性性中毒性性菌痢。。B、慢性细细菌性痢痢疾：慢性迁延延型、慢慢性隐伏伏型、慢慢性急性性发作型型。三、微生生物检验验（一）检检验步骤骤（程序序）检样→样品处理→增菌培养养→SS、EMB平板分离离培养→初步生化化鉴定→最后血清清学鉴定定→报告

（二）检检验操作作要点志贺氏菌菌在常温温中生存存的时间间较短，，应尽快快进行试试验。如24h内不能检检验，样样品应在在冰箱内内长时间不不能检验验，放在在低温冰冰箱内。。1、增菌培培养培养基：：GN增菌液在36±1℃6—8h，当培培养液出出现轻微微混浊即即中止培培养。2、分离离培养强选择性性平板：：SS或或HE、、WS弱选择性性平板：：EMB或麦康数数在工作中中36±1℃培养18—24h，，菌落特征征：无色透明明，中等等大小，，光滑圆圆形菌落落。

HE平板原理理及反应应发酵乳糖糖的某种种肠杆菌菌不发酵乳乳糖的某某种肠道道菌，而而且产生生硫化氢氢，可能能是沙门门氏菌不发酵乳乳糖的肠肠道菌，，可能就就是志贺贺氏菌SS平板原理理及反应应SSAgar(SalmonellaShigellaAgar))大肠杆菌菌或者别别的发酵酵乳糖的的肠杆菌菌是沙门氏氏菌。有有黑色中中心。如果没有有黑色中中心，就就很可能能是志贺贺氏菌了了麦康凯琼琼脂平板板EMB平板照片片及原理理3、初步生生化鉴定定从平板上上挑取3—4个可疑菌菌落，接接种于TSI和葡萄糖糖半固体体培养基基各一管管，36℃，18—24h，

三糖铁（（TSI）琼脂试试验的原原理2－志贺氏氏菌3－沙门氏氏菌4－大肠杆杆菌葡萄糖半半固体原原理及结结果。OrganismTestResult1.Pseudomonasaeruginosa（铜绿假假单胞菌菌）：Motile2.Staphylococcusaureus：Non--motile3.Bacillussubtilis：Motile志贺氏菌菌在TSI生长长的结果果（现象象）：（1）斜斜面产碱碱仍为红红色或粉粉红色；；（2）底底层产酸酸不产气气，变黄黄色；（3）不不产H2S，不不出现黑黑色。

志贺氏菌菌在半固固体培养养基生长长：沿线线生长，，无动力力。在志贺氏氏菌检验验中可弃弃去的培培养物：：（1）在TSI表面上呈呈现蔓延延生长的的培养物物（2）在18~24h发酵乳糖糖、蔗糖糖的培养养物（3）不分解解葡萄糖糖，只在在半固体体培养基基表面生生长的培培养物。。（4）产气的的培养物物（5）有动力力的培养养物（6）产H2S的培养物物4、血清学学试验和和生化鉴鉴定试验验（1）血清学学分型：：凡凝为志志贺氏菌菌，挑取三糖糖铁琼脂脂上的培培养物，，做玻片片凝集试试验。先用4