代谢工程概述

主要参参考书书代谢工工程，，赵学学明等等译，，化学学工业业出版版社，，北京京。2003年年12月Biotechnology,2nded.Vol.1;BiologicalFundamentals.RehmH-JBBiotechnology,3ndedVol.3;Bioprocessing.RehmH-JB途径工工程，，张惠惠展，，2003基因工工程原原理，，吴乃乃虎，，2004代谢工工程，，张蓓蓓等，，天津津大学学出版版社，，200301绪绪论代代谢谢工程程概述述授课教教师：：李强强本章内内容§1.1代代谢工工程的的产生生和概概念的的演变变§1.2代代谢工工程的的研究究内容容§1.3代代谢谢工程程的应应用领领域和和前景景第一节节代谢工工程的的产生生和概概念的的演变变现代生生物技技术手手段主主要包包括基基因工工程(GeneEngineering)、、细胞胞工程程(CellEngineering)、发发酵工工程(FermentationEngineering)、、酶工工程(EnzymeEngineering)和和生化化工程程(BiochemicalEngineering)，，现代代生物物技术术在化化工、、医药药卫生生、农农林牧牧渔、、轻工工食品品、能能源和和环境境等领领域都都将发发挥重重要作作用，，可促促进传传统产产业的的改造造和新新型产产业的的形成成，对对人类类社会会产生生深远远影响响。其其中发发酵工工程是是生物物技术术的重重要组组成部部分，，是生生物技技术转转化成成产品品的重重要环环节。。20世纪纪90年代代提出出的代代谢工工程发发展迅迅速，，被视视为继继传统统的蛋蛋白质质多肽肽单基基因表表达（（第一一代基基因工工程））、基基因定定向突突变（（第二二代基基因工工程））之后后的第第三代代基因因工程程。代谢研研究的的产生生和发发展历历史微生物物发酵酵已经经有几几千年年的历历史。。早在2000年年以前前，人人们就就开始始利用用微生生物进进行白白酒、、黄酒酒、清清酒的的发酵酵，此此时的的发酵酵为天天然发发酵时时代。。20世世纪40年年代，，随着着抗生生素青青霉素素的发发酵生生产的的大规规模进进行，，开始始了现现代发发酵工工业时时代。。通过过自然然选择择的方方法，，人们们用10-6的突变几几率来筛筛选所谓谓的高产产菌株。。由于没有有代谢控控制发酵酵理论作作为指导导，直到到20世世纪60年代现现代发酵酵工业仍仍处于盲盲目阶段段。1957年，日日本的木木下等人人开始了了谷氨酸酸的发酵酵研究。。随着各各国对代代谢发酵酵理论的的深入研研究，许许多国家家转向发发酵菌株株本身的的研究，，获得了了许多的的氨基酸酸高产菌菌株。随后，核核酸类物物质发酵酵生产菌菌也以代代谢控制制发酵理理论为指指导进行行选育，，并奋起起直追成成为后起起之秀。。早期的代代谢研究究主要内内容*早期研研究中侧侧重应用用过程中中采用的的方法及及所达到到的目标标，通常常是对细细胞特定定的代谢谢途径进进行改造造。**代谢谢控制发发酵就是利用用遗传学学的方法法或生物物化学方方法，人人为地在在DNA分子水水平上改改变和控控制微生生物的代代谢，使使目的产产物大量量的生成成、积累累的发酵酵。代谢谢控制发发酵的核核心为：：解除微微生物代代谢控制制机制，，打破微微生物正正常的代代谢调节节，人为为地控制制微生物物的代谢谢。随着代谢控制制发酵理论的的日臻完善，，目前已发展展出一个重要要的研究分支支——代谢工工程。它是近近年来分子生生物学、生物物化学、化学学工程学和计计算机科学的的发展与交差差的产物，从从而使生物技技术突飞猛进进的发展，使使有关的研究究进入了细胞胞水平。从细细胞的代谢途途径出发，运运用工程学原原理进行代谢谢调控，使之之向产物积累累的方向发展展，由此创建建了一个新兴兴的领域，即即“代谢工程程”。途径工程Pathwayengineering利用DNA重组技术修饰各种代谢途径，提高特定代谢物的产量1988，Macquitty代谢工程Metabolicengineering利用DNA重组技术优化细胞酶活、运输和调控功能，提高细胞活力1991，Bailey代谢途径工程Metabolicpathwayengineering生化途径的修饰、设计与构建1991，Tongetal代谢工程Metabolicengineering利用DNA重组技术对代谢进行目的性修饰1993，Cameron代谢工程/代谢设计Pathwayengineering/Metabolicdesign改造细胞代谢途径，提高提高天然最终产物产量或合成新产物1994，pieperberg**代谢工程程概念演变代谢工程Metabolicengineering对生化反应的代谢网络进行目的性修饰1994，Gregory代谢工程Metabolicengineering为达到所需目标对活细胞的代谢途径进行修饰1996，william代谢工程Metabolicengineering利用分子生物学原理系统分析代谢途径，设计合理的遗传修饰战略，从而优化细胞生物学特性1999，koffasl**代谢工程程的现代概念念代谢工程也被被人们成为““途径工程””，它属于基基因工程的一一个重要的分分支。它应用用重组DNA技术和应用用分析生物学学相关的遗传传手段，进行行有精确目标标的遗传操作作，改变酶的的功能输送体体系的功能，，以改进细细胞某些方面面的代谢活性性的整套操作作（包括代谢谢分析、代谢谢设计、遗传传操作、目的的代谢活性的的实现）是一一种生物化学学反应代谢网网络有目的的的修饰。代谢工程的一一些基本定义义底物：培养基基质中的化合合物，是能被被细胞进一步步代谢或直接接利用构成细细胞组分。碳碳源、氮源、、能源物质以以及满足细胞胞功能必须的的各种矿物质质元素均属于于细胞代谢的的底物。代谢产物：由由细胞合成的的化合物，可可以是初级代代谢产物（二二氧化碳、乙乙醇等），也也可以是次级级代谢产物或或者蛋白质。。生物基质要素素：构成生物物质大分子池池的一类物质质，包括DNA、RNA、蛋白质等等代谢工程的一一些基本定义义代谢流和碳骨骨架物质流：：代谢物在代代谢途径中流流动形成代谢谢流。在代谢谢工程领域代代谢流往往是是指骨架物质质流。代谢主流：在在一定的培养养条件下，代代谢物再代谢谢网络中流动动，流量相对对集中的代谢谢流叫做该条条件下的代谢谢主流。代谢谢途径的延伸伸和改变都会会改变代谢主主流，从而实实现新基质的的利用和新产产品的开发。。代谢主流的的测定是代谢谢工程的重要要组成部分。。代谢工程的一一些基本定义义载流途经：代代谢主流流经经的代谢途径径为主要载流流途经，简称称载流途经。。在代谢工程程研究中载流流途经是指碳碳流在代谢网网络中通过的的主要途径。。代谢主流的变变动性和选择择性：生物细细胞的代谢主主流处于不断断的变化之中中，其方向、、流量甚至代代谢主流的载载流途经都可可能发生变化化。这就是代代谢主流的变变动性和代谢谢主流对代谢谢网络途径的的选择性。这这种变动和选选择的根据在在于生物细胞胞的遗传物质质，选择的原原因在于细胞胞所处的环境境条件的变化化。代谢工程的一一些基本定义义代谢途径定义义为：一连串串可以进行的的并可观测的的生物化学反反应步骤，这这些反应步骤骤是以指定的的一组输入和和输出代谢物物所连结。代谢工程的一一些基本定义义代谢网络：在在代谢过程中中,通过特定定的生物化学学反应,一些些物质被分解解,从而为基基本的生命过过程提供能量量,同时合成成另一些生命命所必需的物物质。发生在在某物种的活活细胞内所有有代谢反应构构成了此物种种的代谢网络络。对蛋白质层次次的代谢网络络来说，一个个代谢物分子子就是一个节节点，而节点点之间的连结结则是生化反反应。大部分分的分子只参参加一种或两两种反应，但但少数分子参参与许多反应应，它们实际际上就是代谢谢流的集散中中心或通用代代谢物代谢工程的一一些基本定义义代谢通量定义义为：输入代代谢物反应生生成输出代谢谢物的速率。。胞内代谢通量量的确定称为为代谢通量分分析（metabolicfluxanalysis，MFA）），其在代代谢工程处于于中心地位。。代谢工程的一一些基本定义义代谢控制分析析(MCA)*ＭetabolicControlAnalysis，简称ＭＭＣＡ代谢工程的一一个主要目标标就是对代谢谢通量控制的的理解。其是通过途径径中酶的活性性、代谢物、、效应物和其其它参数所施施加的通量控控制程度进行行定量表述。。代谢控制的关关键参数确定定以后，人们们需要实施这这些变化从而而最有效地达达到预定目标标。在实施通量控控制的策略中中，无论采用用哪种路线，，为获得最佳的的结果，都应应将基因修饰饰和环境条件件改变结合起起来使用。第二节代谢工程的研研究内容代谢工程的实实质在于对代代谢网络进行行定量分析，，并且在此基基础上进行代代谢改造（代代谢网络重组组），以最大大限度地提高高代谢产物的的产率。主要内容：生物合成相关关代谢调控和和代谢网络理理论代谢流的定量量分析代谢网络的重重新设计中心代谢作用用机理及相关关代谢分析基因操作代谢工程研研究的目的的通过重组DNA技术术构建具有有能合成目目标产物的的代谢网络络或具有高高产能力的的工程菌(细胞株、、生物个体体)并用于于生产是代代谢工程研研究的主要要目的。代谢网络理理论代谢网络理理论是把细细胞的生化化反应以网网络整体而而不是孤立立地考虑。。细胞代谢谢的网络由由上万种酶酶催化的系系列反应系系统、膜传传递系统、、信号传递递系统组成成，并且既既受精密调调节，又彼彼此互相协协调。代谢网络理理论是代谢谢工程研究究的基础代谢分析代谢分析是是代谢工程程的重要组组成部分，，它涉及代代谢流的定定量和定向向、研究细细胞内代谢谢物浓度的的反应工程程方法以及及细胞内稳稳态流分析析等代谢工程的的实质代谢工程最最重要的贡贡献在于其其强调在胞胞内条件下下代谢通量量及其调控控。代谢工程的的实质是：：将通量及及其控制进进行量化的的方法与分分子生物学学技术结合合起来，用用以执行所所建议的基基因修饰任任务。当反反复利用代代谢工程方方法时，它它就为在很很广范围内内系统改进进细胞的性性质提供了了一种强有有力的方法法。通量是细胞胞生理学的的一个基本本决定因素素，也是代代谢途径中中最重要的的参数。代谢工程与与随机诱变变的区别尽管定向性性从某种意意义上来讲讲是所有菌菌种改进工工作的固有有特性，但但是代谢工程与与随机诱变变相比，其其工作焦点点致力于定定向性，以以致其在目目标酶的选选择、实验验设计以及及数据分析析等方面都都起着重要要的作用。。另一方面，，细胞的定定向改进应应解释为合合理的途径径设计与修修饰，因此此在这个意意义上说，，代谢工程程与随机诱诱变是完全全不同的。。实际上,通过随机机诱变而得得到的性能能优良的菌菌株能够作作为关于途途径结构与与控制方面面重要信息息的来源，，这可经由由反向代谢谢工程获取取。代谢工程也也包括两个个明确的步步骤：即分分析与合成成。因为代代谢工程是是随着DNA重组而而出现的可可行技术，，所以最初初代谢工程程几乎都集集中于这个个领域的合合成方面:如在各种种宿主细胞胞中新基因因的表达、、内源酶的的扩增、基基因的缺失失或酶活性性的调节、、转录的或或酶的解除除调控等。。因此，代代谢工程在在很大程度度上曾是应应用分子生生物学的技技术体现，，而很少带带有工程方方面的内容容。*代谢工程程的主要特特征代谢工程的的主要特征征就是利用用DNA重重组技术，，重建代谢谢网络，改改变代谢流流及分支代代谢速度，，以改进代代谢产物及及蛋白类产产品，由于于外源DNA的引入入扩展了固固有的代谢谢途径，获获得了新的的化学物质质。改变转转化蛋白的的过程，减减少不必要要的废物。。**代谢工工程研究的的主要问题题提高细胞已已有的代谢谢途径中天天然产物的的产量改变细胞已已有代谢途途径，合成成新产物对不不同同细细胞胞的的代代谢谢途途径径进进行行整整合合，，构构建建全全新新的的代代谢谢途途径径优化化细细胞胞的的生生物物学学特特性性，，如如生生长长速速率率、、耐耐受受性性等等。。代谢谢工工程程的的研研究究手手段段1.采采用用遗遗传传学学手手段段的的遗遗传传操操作作（1））基基因因工工程程技技术术的的应应用用（2））常常规规诱诱变变技技术术的的应应用用2.生生物物合合成成途途径径的的代代谢谢调调控控（1））生生物物合合成成中中间间产产物物的的定定量量生生物物测测定定（2））共共合合成成法法在在生生物物合合成成中中的的应应用用（3））酶酶的的诱诱导导合合成成和和分分解解代代谢谢产产物物阻阻遏遏（4））无无机机磷磷对对生生物物合合成成的的调调节节3.研研究究生生物物合合成成机机制制的的常常用用方方法法（1））刺刺激激实实验验法法（2））同同位位素素示示踪踪法法（3）洗洗涤菌丝丝悬浮法法（4）无无细胞抽抽提法（5）遗遗传特性性诱变法法代谢工程程的研究究方法1分子生生物学方方法：构构建特殊殊的基因因转移系系统，尤尤其对于于具有较较高生产产价值的的微生物物，具有有重要意意义。例例如Backman等等利用切切割载体体获得Tyr营营养突变变型，为为构建苯苯丙氨酸酸的生产产菌株奠奠定基础础。2分析化化学及检检测方法法：代谢谢工程的的研究对对象是代代谢途径径，因此此必须对对代谢通通路中的的一些酶酶及产物物进行研研究和分分析。传传统的分分析通路路阻断的的手段有有：物质质平衡、、同位素素标记、、分析障障碍突变变体等，，目前它它们仍然然是必不不可少的的手段，，而核磁磁共振、、流氏细细胞术的的应用则则为这一一领域的的发展增增添了新新的活力力。3数学及及计算机机工具：：研究代代谢工程程不仅需需要遗传传学知识识，而且且需要对对宿主菌菌的生化化代谢途途径和生生理学有有深入的的理解，，所以将将DNA数据库库的信息息应用于于代谢工工程并开开发出适适合的软软件系统统是十分分必要的的，Karp等等构建了了981个生命命体化合合物数据据库，为为未来的的发展奠奠定了基基础。人人们已在在实验的的基础上上结合数数学和化化学的理理论，发发展了一一些人工工智能程程序。代谢工程程的基本本过程1、代谢谢分析与与代谢设设计：代代谢工程程的研究究对象是是代谢途途径，因因此必须须对代谢谢网络中中的一些些酶及产产物进行行研究和和分析。。根据代代谢流的的分析确确定代谢谢设计的的合理靶靶点，设设计合适适的代谢谢工程操操作手段段，对于于靶点进进行改造造，达到到改造代代谢的目目的。代谢工程程的基本本过程2、基因因操作：：代谢改改造的核核心是在在分子水水平上对对于靶基基因或基基因簇进进的克隆隆、表达达、修饰饰、敲除除、调控控、构建建特殊的的基因转转移系统统以及重重组基因因在细胞胞染色体体DNA上的稳稳定整合合。代谢工程程的基本本过程3、效果果分析：：通常一一次性的的代谢设设计和基基因操作作往往不不能达到到实际生生产所要要求的产产量、速速率或浓浓度。因因此对于于一次代代谢改造造的效果果分析，，得到本本次操作作的优点点和缺点点数据，，改进缺缺陷，综综合优势势，进行行下一次次代谢改改造，经经过不断断的改造造和分析析，可以以得到好好的结果果。代谢工程程的三个个基本观观点随着生物物化学、、细胞生生物学、、应用分分子生物物学、遗遗传工程程和代谢谢工程的的发展，，工业发发酵正在在经历一一个从技技艺到科科学的重重大变化化，正在在向微生生物生物物工程过过渡。在在生物工工程受到到广泛重重视的今今天，有有必要把把微生物物(菌种种选育)、微生生物学过过程(发发酵工艺艺)和微微生物学学体系(生物反反应器)作为一一个整体体，在科科学的水水平上对对工业发发酵进行行重新审审视。代谢工程程的三个个基本观观点从工业发发酵的现现状出发发，主要要根据对对碳元素素代谢及及其控制制，菌种种是化能能异养型型微生物物，产物物是微生生物细胞胞排出细细胞的代代谢中间间产物的的工业发发酵，提提出了3个基本本观点。。**代谢工程程的三个个基本观观点1．1生生物能能支撑观观点微生物细细胞是工工业发酵酵产物的的生产者者，微生生物细胞胞的生长长和维持持需要由由其自身身的能量量转换机机构或从从其他形形式的能能量转化化形成的的生物能能来支撑撑。因此此，工业业发酵具具有生物物学属性性。1．2代代谢网网络观点点由生化反反应网络络和跨输输送步骤骤组成的的代谢网网络既没没有绝对对的起点点，也没没有绝对对的终点点。代谢谢网络中中任何一一种中间间产物(或可借借助生物物学、化化学方法法与代谢谢网络联联网的任任何一种种化合物物)都可可能被开开发成为为工业发发酵的目目的产物物或原料料。1．3细细胞经经济观点点微生物细细胞的经经济性是是在自然然选择的的过程中中逐渐形形成的。。野生的的(未经经人工变变异的)微生物物细胞在在自然选选择的过过程中逐逐渐形成成竞争型型的细胞胞经济。。而工业业发酵往往往要以以目的产产物的生生产为主主导，调调整代谢谢网络中中的代谢谢流，构构建一种种导向型型细胞经经济。从从竞争型型细胞经经济的转转变取决决于遗传传和环境境因素的的信息导导向，这这种导向向必须遵遵循细胞胞经济的的基本运运行规律律。代谢工程程研究的的设计思思路在具体的的设计和和操作中中,一般般从以下下方面着着手:1)提高高通向目目标产物物的代谢谢流;2)扩展展代谢途途径;3)构建建新的代代谢途径径。提高高通向目目标产物物的代谢谢流的手手段通常常有:a、增强强催化限限速反应应的酶的的表达量量或活性性,从而而提高代代谢流;b、在有有竞争途途径(如如分支代代谢途径径)存在在时,阻阻断有害害的或无关关的竞争争代谢途途径代谢谢产物的的合成,从而达达到改变变代谢流流,提高高目标产产物产量量的目的的。扩展代谢谢途径一一般是指指通过基基因工程程手段引引入外源源基因(簇)等等,使原原有代谢谢途径进进一步向向前或向向后延伸伸,从而而可利用用新的原原料用于于合成目目标产物物或产生生新的末末端代谢谢产物。。构建新新的代谢谢途径一一般是指指引入外外源基因因(簇)来改造造和修饰饰代谢网网络,使使细胞从从不能合合成某种种代谢产产物转变变为能够够合成此此代谢产产物。常用的手手段有:a、转移移代谢途途径,即即将多个个特定代代谢途径径中的相相关基因因(簇)转移到到无这些些基因的的菌株(或植物物细胞等等)中,从而达达到使其其能合成成新的目目标产物物的目的的;b、将无无关的代代谢途径径相连,形成新新的代谢谢途径,从而合合成新的的目标产产物。习题ＭetabolicControlAnalysis，简简称ＭＣＣＡ第三节、、代谢工工程的应应用领域域和前景景代谢工程程和微生生物发酵酵工业要要解决的的根本问问题是:如何有有效地改改造微生生物菌种种,使其其高效地地发酵生生产各种种产品。。代谢工程程是利用用基因工工程技术术改造细细胞的代代谢，以以改善细细胞的性性能的一一门新兴兴学科。。2003年美美国贝克克莱大学学J.Keasling，采采用酵母母细胞表表达天然然植物药药箐篙素素分子，，实现工工程微生生物代谢谢工程制制药。采采用系统统生物学学原理和和转基因因生物技技术、计计算机软软件辅助助设计技技术，将将细胞内内次生代代谢反应应链重新新设计、、人工合合成基因因与基因因调控网网络，从从而进入入了代谢谢工程、、基因工工程的合合成生物物学-系统统生物学学基础的的遗传工工程时代代。代谢工工程的的主要要目标标是识识别特特定的的遗传传操作作和环环境条条件的的控制制，以以增强强生物物技术术过程程的产产率及及生产产能力力，或或对细细胞性性质进进行总总体改改性。。本书书最主主要的的内容容包括括途径径集成成和把把代谢谢通量量作为为细胞胞生理理学的的基本本决定定因素素来考考虑的的重要要性。。代谢谢工程程把数数学的的复杂杂性减减到最最小，，并同同时提提供一一些必必要的的补充充说明明作为为不同同数学学运算算的背背景材材料发酵产产品代谢工工程研研究的的第一一步必必然是是先确确定要要发酵酵生产产什么么产品品。微微生物物发酵酵产品品主要要分为为3大大类:可再再生能能源、、大宗宗化学学品(和生生物材材料)、精精细化化合物物。可可再生生能源源类目目前研研究的的比较较多的的是纤纤维素素乙醇醇、生生物柴柴油、、丁醇醇,然然而目目前的的生物物能源源有着着很多多缺陷陷,将将来很很有必必要开开发品品质高高、原原材料料丰富富的下下一代代生物物能源源,如如长链链醇、、油酯酯和碳碳氢化化合物物。大大宗化学品类目目前研究比比较多的是是柠檬酸、、溶剂、乳乳酸、聚羟羟基烷酸、、1,3-丙二醇、、丁二酸以以及这些化化学品聚合合生产的生生物材料(如生物塑塑料、生物物橡胶）然而目前能能工业化发发酵生产的的大宗化学学品数量还还非常有限限。将来很很有必要继继续开发生