米曲霉遗传操作及分子生物学研究进展

米曲霉遗传操作及分q生物学研究进展摘要:米曲霉(A.oryzae)不仅在传统食品发酵、酿造和调味品等行业中具有悠久的应用，而且在现代生物技术产业比如酶制剂和重组蛋白的生产等方面的应用也日益广泛%这主要是由于A.oryzae是食品安全级真菌，具有较强蛋白酶分泌活性，并且在高盐浓度环境下可以正常生长％由于其菌丝体和K子均存在多核现象并且遗传操作相对困难，所以关于其功能基因的研究近年来才陆续取得一些进展％本文对与A.oryzae分子生物学相关的研究如功能基因、蛋白)分泌和耐盐、遗传操作方法和基因编辑等进行了综述％关键词：米曲霉;真菌;分子生物学；遗传操作;基因编辑ResearchProgressofGeneticManipulationandMolecularBiologicalinAspergillusOryzaeAbstract；Aspergillusoryzae(!.oryzae)hasbeenlongusednotonlyintraditionalfoodfermentation,condimentandbrewingindustries,butalsoinmodernbiotechnologicalindustriessuchasenzymepreparationandrecombinantproteinsproduction.ThisismainlybecausethatA.oryzaeisafood-safetyfunguswithstrongproteasesecretionactivityandcangrownormallyunderhighsaltconcentrationenvironment.Duetothemultinuclearphenomenonofitsmyceliumandsporesandtherelativedifficultyingeneticmanipulation,someprogresshasbeenmadeinthestudyofitsfunctionalgenesinrecentyears.Inthisreview,theresearchonthemolecularbiologyofA.oryzaesuchasfunctionalgenes,proteasesecretionandsalttolerance,geneticmanipulationmethodsandgenomeeditingaresummarized.Keywords；Aspergillusoryzae;fungus;molecularbiology;geneticmanipulation;genomeediting般地，米曲霉菌)为白色，分生抱子为黄绿色，但会—、前言因酸度的不同而呈现出不同的颜色％在较大酸度的米曲霉是一种好气性真菌，在分类学上归属于子囊菌门、散囊菌纲、散囊菌目、曲霉科、曲霉属。培养基上呈绿色，在较小酸度的培养基上呈黄色，老化后逐渐变为褐色。分生抱子梗生长在厚壁的足细胞上，分生抱子头呈放射形，顶囊球形或瓶形，其最适培养温度为30-37米曲霉作为我国酱油、传统酿造食品和酒类的生产菌种，大量存在于粮食、发酵的食品、腐败的有机物及土壤中囚。米曲霉在工业上主要应用于调味品和酶制剂行业以及重组蛋白的生产等，并且其发酵及下游处理工艺已渐趋成熟。米曲霉被广泛应用于工业的原因主要包括：其一是米曲霉在中国传统食品酿造中应用有近千年历史，并且已经被美国FDA和WHO认定为安全生产菌株（GRAS）；其二是具有较强蛋白酶分泌活性并且在高盐浓度环境下可以正常生长。关于米曲霉的研究，国内多数集中在调味品和酶制剂的生产等方面，而国外则多数集中在基因表达调控、异源蛋白表达和次级代谢物开发（如异黄酮、聚酯降解材料）等方面然而，目前关于米曲霉的功能基因、分泌蛋白）和耐高盐分子机制的研究较分散，而本文对与米曲霉分子生物学相关的研究如功能基因、蛋白）分泌和耐盐、遗传操作方法和基因编辑等进行了综述。二、米曲霉功能基因的研究进展2005年，日本的科研机构与企业联合共同完成了米曲霉RIB40（ATCC42149）的基因组测序工作，约有3800万个碱基对，共有8条染色体包含约1.2万个基因4米曲霉基因组测序的完成为其分子生物学研究打下了一个良好的基础。比较发现,米曲霉RIB40基因组中含有12,074个编码蛋白质的基因电与酿酒酵母相比，两者共同的基因只有4000个时。随着基因组测序的完成,米曲霉的功能基因组学应运而生。基于生物信息学研究对米曲霉功能基因的解析取得了很大进展°例如，Maeda等&刀通过基因芯片分析了米曲霉在含葡萄糖和不含葡萄糖液体培养条件下的基因表达谱，从而揭示了糖代谢途径、TCA循环、电子传递链等相关酶系的差异表达基因。我们［8］通过分析不同生长时期的米曲霉转录组，揭示了在其在不同生长时期不同类型基因表达的变化。Takeshi等回通过分析9种不同培养基（涉及营养、温度、pH值和培养基的状态等因素）生长的米曲霉基因表达序列标签EST文库，揭示了不同条件下偏好表达的基因，并且通过分析黄曲霉毒素合成基因簇发现米曲霉或是因其基因簇部分基因缺失，或是因其激活基因转录的调节因子缺失，使得黄曲霉素合成基因不能表达，进而从分子水平解释了米曲霉的安全性。Terabayashi等&坷通过转录组分析了低氧条件下米曲霉的基因表达谱。Zhou等人&11'通过转录组研究鉴定了米曲霉在非折叠蛋白反应（UPR）中的相关基因。我们凹前期通过盐胁迫下转录组分析发现不饱和脂肪酸和精氨酸均参与到米曲霉的盐胁迫响应过程。另外，蛋白质组学在米曲霉蛋白分泌方面也有应用。2006年,Oda等问最早利用蛋白质组学的方法探讨了米曲霉在固体和液体培养条件下胞外蛋白）的分泌情况，并通过质谱鉴定总共确定了29个蛋白。随后,也有其它相关研究通过蛋白质组学和分泌组学来分析鉴定米曲霉分泌蛋白网。我国学者赵国忠等人［15-171也通过基因组学、转录组学和蛋白质组学等研究了米曲霉酸性蛋白酶活性的调控机理，为其工业应用奠定了良好的基础。另外将米曲霉基因异源表达、对其功能进行鉴定等也对解析米曲霉功能基因有一定贡献。例如，我们［18'19］通过异源表达、体外生化实验鉴定了米曲霉酰基辅）A结合蛋白的生理生化功能。EST分析、基因芯片、转录组学和蛋白组学等技术的利用极大地促进了米曲霉功能基因的研究，同时使得米曲霉在工业、农业和医药等行业的应用潜力也相应提高。三、米曲霉胞外蛋白酶活性的相关研究进展蛋白）是能水解蛋白质肽链的一类）的总称。按其水解蛋白肽键的位置，可分为外肽）和内肽）两类°外肽）即水解底物蛋白的N端或者C端的肽键，而内肽）则作用于蛋白分子内部的肽键。米曲霉能够向胞外分泌蛋白），而这些蛋白）在发酵的过程中可以使原料中的蛋白质分解为多肽和多种氨基酸，因此其在传统食物酿造和调味品制剂方面有着广泛的应用㈣。通过对米曲霉RIB40基因组分析发现，其共有134个肽）基因，其中内切酶65个、外切）69个,占基因组中基因总个数的1%,这表明蛋白）对米曲霉自身的生存也是十分重要的。而目前报道的蛋白）才18种时,大部分没有确定其具体功能。米曲霉较强的胞外蛋白酶活性一方面得益于其基因组中存在着很多蛋白）编码基因，另一方面得益于其强大的蛋白分泌能力。丝状真菌蛋白的高效分泌一般为顶端分泌,即一般发生在菌）的顶端或者亚顶端刖。这可以通过在黑曲霉、米曲霉及构巢曲霉中分别利用绿色荧光蛋白标记参与分泌途径的蛋白来证实皿明。与其他真核生物相比，丝状真菌拥有SRP信号传导、内质网蛋白质翻译后修饰系统、错误折叠蛋白降解、囊泡与靶膜间的融合以及顶端分泌等更为强大的分泌途径网。四、米曲霉耐盐的相关研究进展外界环境中的高浓度盐离子可以影响真菌的渗透压，进而引发渗透胁迫，最终导致真菌细胞膜损伤、细胞内电解质渗漏，引起细胞死亡。而在酱油发酵过程中，米曲霉能在高达18%的NaCl环境下生长四，但是关于米曲霉应答盐胁迫的分子机制了解得比较少。通过对酵母和其它真菌的研究发现，真菌应对环境中高盐胁迫主要通过高渗甘油（HOG）途径来实现的。模式真菌酵母可以通过调节关键基因HOG1来调控一系列激酶信号通路，进而影响甘油的合成来维持细胞内部的渗透压平衡四。近年来的研究逐渐揭示了真菌hog途径下游复杂的调控网络以及对甘油合成的影响，但是对于其上游调控因子的研究却相对欠缺㈣。我们回通过转录组分析发现盐胁迫条件下精氨酸和油酸合成的相关基因表达上调；通过代谢组分析发现精氨酸和油酸含量增加，表明它们可能参与到米曲霉的耐盐过程；同时通过全基因组分析发现米曲霉基因组中包含90个HOG同源基因，并且通过转录组分析发现这些基因在盐胁迫下转录水平都发生了显著变化四。这些结果从转录组和基因组层面揭示了米曲霉耐盐的一些机制。另外，通过对米曲霉耐盐蛋白的异源表达纯化也表明，米曲霉中一些蛋白在高盐环境中仍然保持较高活性。例如，通过原核表达纯化米曲霉3.042中的天冬氨酰氨基肽）发现该酶在高盐、高温的条件下仍然可以保持较高活性，这从另外一方面揭示了米曲霉耐盐的机制㈣。五、米曲霉基因工程的研究进展对于丝状真菌的遗传操作，筛选标记是首先要考虑的问题。它一方面决定了转基因能否进行，另一方面决定了假阳性出现的概率和筛选的工作量。真菌遗传转化常用的筛选标记主要包括营养缺陷型和药物抗性基因两大类。常用于米曲霉转化的营养缺陷型标记基因主要包括：编码乳清酸核F-5-磷酸脱：）的pyrG基因、编码鸟氨酸氨甲酰基转移）的argB基因、编码硝酸盐还原）的niaD基因及其同源基因、编码氨基咪.核F酸合成）的adeA和编码磷酸核糖酰氨基眯.：化）的adeB及其同源基因等［29-32］，这些筛选标记及筛选机理见表1。使用药物抗性基因作为转基因筛选标记的优点是其不要求构建营养缺陷型受体菌，在受体菌株基因型未知的情况下可以直接用于转化，因此应用广泛。常用的药物抗性标记主要包括G418、潮霉素、寡霉素、博来霉素、腐草霉素、卡那霉素等，其中以潮霉素B抗性基因hph在真菌转化系统中应用最为广泛"33%。然而米曲霉对于这些常用抗性药物均不敏感，因此很少使用抗性基因来进行米曲霉遗传转化。MN硫胺素（PT）是维生素B1的拮抗剂，从中筛选获得了米曲霉毗N硫胺素抗性菌株，从中克隆了PT的抗性基因（ptrA）,并将该基因成功用于米曲霉的筛选标记，从而米曲霉有了有效地抗药性筛选标记，方便了对米曲霉转化子的筛选，极大的促进了米曲霉的分子生物学研究［34'351。但是利用ptrA作为筛选标记有其缺点：一是PT比较贵；二是ptrA很容易与米

曲霉染色体上固有的ptrA基因发生同源重组而产生固有的抗性，从而不便于筛选；三是PT作为维生素B1的拮抗剂，只有在培养基中完全不含维生素B1的情况下才能抑制米曲霉生长，发挥筛选作用,但是在遗传转化过程中（特别是原生质体介导的遗传转化）容易发生细胞破碎,释放出细胞内固有的维生素B1从而影响筛选效率％表1米曲霉转基因方法及筛选标记菌株菌株的来源筛选标记/筛选机制转基因方法参考文献niaD300以RIB40为背景诱变获得niaD突变体只能利用亚硝酸盐做氮源，转化子能在硝酸还原酶培养基生长PMT[36]FN-16!amdS以FN-16为背景诱变获得a%&（非转化子在蔗糖和CsCl培养基）长受限，转化子可以正常生长PMT[37]NS4以niaD300为背景紫外诱变sC突变体不能在以NO3-和SO*-为唯一PMT[38]获得氮源和硫源的培养基生长PTR26以HL1034为背景亚硝基n诱变获得含ptrA的转化子可以在含,比；硫胺素培养基生长PMT[39]NSR13/NSR1adeA/adeB双突变只能在外源添加腺,票以NS4为背景紫外诱变获得吟的培养基生长，转化子无需外源添加腺票吟PMT[40]NSAR1以NSR13为背景，构建敲除载体，通过同源重组敲除argB突变体需要外源提供精氨酸才能生长PMT[41]Bleomycin-resistancemutantRIB40野生型在ligD突变体中表达博来霉素基因，菌株可以在含Bm培养基生长PMT[42]AUT1-P1D/AS11,C2/以RIB40/3.042/VS1等为背pyrG突变体需要外源提供尿＜；才能PMT[32，43-4A]VS1!pyrG景紫外诱变获得1生长RIB40/以RIB40为背景,通过同源重组敲除获得pyrG突变体需要外源提供尿＜；才能生长ATMT[32，46]3.042/以3.042为背景，通过同源重pyrG突变体需要外源提供尿＜；才能ATMT[36]ApyrG组敲除获得生长丝状真菌转基因主要有2种方法:原生质体介导的转基因（PMT）和农杆菌介导的转基因（ATMT）。前者通常是PEG-CaCl介导的原生质体（Protoplasts/PEG）转化，其主要原理是利用PEG等多聚物、二价阳离子（Mg2+*Ca2+*Mn2+）和要转化的外源DNA在原生质体表面形成沉淀颗粒，然后再通过原生质体的内吸作用进入受体细胞％受体细胞群体数量大，以原生质体作为受体转基因的优点是容易获得纯合性转化子；而原生质体培养难度大，操作过程需要考虑渗透压等、转基因操作步骤复杂、原生质体再生频率低，并且周期长则是其缺点印也〕。原生质体的状态对转化效率的影响很大，因此使用PMT方法进行转化的前提和基础是要制备高效的原生质体。对于米曲霉而言，目前原生质体介导的转化是主要方法％根癌农杆菌是一种普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，在自然条件下能趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，从而把农杆菌中携带的Ti质粒中的T-DNA转移到植物细胞基因组中％近年来的研究表明，ATMT不仅可以用于植物的转化而且可以用于动物、细菌和真菌的转化％在真菌中，ATMT首先成功应用于酵母㈣,随后ATMT转化技术又扩展应用于其它的丝状真菌，包括构巢曲霉、粗糙脉抱霉、泡盛曲霉、黑曲霉、红曲霉等多种丝状真菌％与PMT比6,ATMT不仅操作简单、转化效率高，而且农杆菌的T-DNA可移区域可以单拷贝地随机插入到受体细胞染色体中°ATMT在）状真菌中的成功应用为其遗传转化提供了新途径，同时在丝状真菌的T-DNA插入突变、基因标记等方面也具有相当大的潜力，拓宽了丝状真菌功能基因鉴定的研究方法。而人们也尝试建立关于米曲霉的农杆菌转基因体系，但是存在诸多困难,主要原因之一是常规的筛选标记比如黑曲霉和红曲霉使用的潮霉素抗性对于米曲霉来说不敏感。2017年越南Nguyen等人123'佝在国际上首次建立了利用尿0N营养缺陷为筛选标记，由ATMT介导的米曲霉转基因体系。我们啊也成功建立了农杆菌介导的尿0N营养缺陷型、硝酸盐还原）和PT为筛选标记的转基因体系，以及同时转化多个筛选标记的转基因体系。该体系的建立极大的促进了米曲霉功能基因的鉴定。关于米曲霉转基因的方法及筛选标记见表1所示。六、基因编辑技术在米曲霉中的应用基因编辑技术是研究基因功能和遗传改造米曲霉十分重要的方法。在米曲霉中成功应用的基因编辑技术主要有TALEN和CRISPR/Cas9技术。TALEN技术是基于TAL效应因子可以与特异DNA序列结合；通过TAL效应因子连接非特异性核酸酶FokI,即形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工