下载本文档
版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领
文档简介
动物基因组DNA的分离与核酸浓度的测定实验方法
先将小鼠肝脏进行预处理：断颈法处死一只小鼠，采集肝脏组织，用生理盐水清洗血污。取一只小鼠的肝脏（约2g），加入20mL匀浆缓冲液（STEbuffer），用电动组织匀浆器匀浆至无明显组织块存在（最好冰浴操作）。将组织细胞的匀浆液体转移至15mL蓝盖离心管中，4℃4000r/min离心15min，弃上清，留沉淀。沉淀中加入6mL消化缓冲液（含蛋白酶K），轻轻反转混匀，50～55℃温育1h。加入RNA酶（10mg/mL）至终浓度200g/mL，37℃水浴0.5h。每小组取1.5mlEP管，加入上述消化细胞液600ul，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，缓慢颠倒离心管使两相均匀混合形成乳浊液，1200r/min，4℃离心10min。小心吸出EP管中的上层液体，即为含DNA的水相，注意不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。然后加入等体积氯仿／异戊醇，12000r/min，4℃离心10min。(如果界面或水相中含蛋白质沉淀较多，可重复操作6～7)小心吸出上层含DNA的水相，加入1/10体积NaAc，充分混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，置－20℃冰箱约2h。12000r/min，4℃离心10min，弃上清液，得到的白色沉淀。加入1mL70％冷乙醇洗涤，继续离心，获得沉淀，室温干燥。加入50LTE缓冲液溶解，即可得到基因组DNA。－20℃冰箱保存。如果要对提取的DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝胶。方法是取1l溶解的DNA样品，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，用溴化乙锭（或Goldenview）染色观察结果。每组取1μL
、2μLDNA样品，加0.4μL电泳上样缓冲液（含溴酚蓝），少量的水（10ul），混匀后加样于琼脂糖凝胶孔内。电泳（小胶100-120V，大胶150-180V）：使DNA移入琼脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移至中间即可停止电泳。用短波紫外线（254nm）进行拍照，比较样品DNA与DNA标准品（marker）的荧光强度（一般最亮的条带为750bp，上样5ul约100ng），并计算出待测样品中DNA的浓度。如果DNA已经降解
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
评论
0/150
提交评论