实验三 细胞的化学成分2课件

实验三细胞主要化学成分的检测

细胞的化学成分细胞的组成：无机物和有机物，有机物主要是四类生物大分子：

多糖

脂肪（脂质、膜）蛋白质核酸实验目的

1、掌握生物大分子在细胞内的存在部位；2、学习细胞内主要化学成分的检测方法；3、掌握徒手切片的制片方法，掌握细胞内不同生物大分子使用不同的染色剂。细胞内多糖的检测1、细胞中多糖的测定（高碘酸-希夫反应PAS）：糖类是生物有机体生命活动能量的主要来源。高碘酸希夫试剂反应，简称PAS反应。PAS反应是利用高碘酸作为强氧化剂，这种强氧化剂能把葡萄糖分子中2-3碳原子之间连接的键打开，使多糖分子中的乙二醇变成乙二醛，氧化所得到的醛基与Schiff试剂反应形成紫红色化合物。颜色的深浅与糖类的多少有关。

PAS反应的应用：1、证明与鉴别细胞内空泡变性，是脂肪变性还是糖原的脱失；2、心脏病变与其它心血管疾病的诊断与研究；3、糖尿病是许多脏器有糖原沉积，在肝脏、肾脏内均有大量糖原沉积；4、某些肿瘤的鉴别诊断，如肝细胞癌糖原反应阳性。细胞内多糖的检测（1）切片：把马铃薯块茎用单面单片徒手切成薄片，取一薄片放在培养皿中；（2）氧化：加高碘酸溶液将薄片浸没氧化5-15min；（3）固定：染色完后将材料移入70%乙醇中浸5min；（4）染色：用Schiff试剂染色15-20min；（5）亚硫酸溶液洗：染色完后用新配制的亚硫酸溶液洗3次，每次1min；（6）蒸馏水冲洗：用蒸馏水冲洗1-2次；（7）装片镜检：将材料转移到载玻片上，盖上盖玻片，置于低倍镜下观察，细胞壁、淀粉粒呈紫红色。细胞内过氧化氢酶的检测（1）用颈椎脱臼法处死小白鼠，剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出股骨；（2）剪断或者折断股骨，用牙签挑取骨髓（或注射器针头吹），涂布于载玻片上制成涂片，晾干；（3）向涂片上滴加几滴0.5%CuSO4，固定1min；（4）倾去CuSO4溶液，滴加0.1%联苯胺混合液，染色6min；（5）用自来水或蒸馏水冲洗材料，滴加1%番红染液，染色1min；（6）用自来水或蒸馏水冲洗材料，空气中晾干，显微镜下观察。骨髓细胞内可见到蓝色或者棕色的颗粒，即为过氧化物酶所在的部位。细胞内DNA的检测3.DNA的细胞化学——Feulgen反应

DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经1mol/LHCl水解，除去RNA，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是碱性品红和偏重亚硫酸钠作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物。因此凡是有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预热的三氯乙酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。此反应不仅可定性地观察DNA存在的部位，还可以定量地进行分析。细胞内DNA的检测（1）将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在盛有1mol/LHCl的小烧杯中，在60℃中水解8-10min；（2）用蒸馏水水洗，洗去材料表面的酸液；（3）用Schiff试剂遮光染色30min；（4）用新配制的亚硫酸水溶液将材料洗3次，每次1min；（5）用自来水或蒸馏水冲洗5次；（6）将根尖放在载玻片上，用镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。（7）显微镜检查，细胞中凡是有DNA分布的部位应呈现紫红色的阳性反应。细胞内RNA的检测

4.RNA的细胞化学——Brachet反应的观察

根据DNA、RNA聚合程度对碱性染料的亲和力不同，甲基绿分子有两个相对的正电荷，与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色，而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA结合使其染成红色。用甲基绿—派洛宁对被观察细胞进行染色，细胞质和核仁被染成红色，细胞核被染成蓝色。小结：

PAS反应用于确定多糖的存在；米伦反应是蛋白质成分的检测方法（双缩脲试剂）；脂肪用苏丹Ⅲ染色呈橘黄色（斐林试剂），四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用来证明脂肪滴的存在；Feulgen反应可以特意地显示DNA的分布，联苯胺反应可以检测过氧化物酶的存在；Brachet反应可以显示DNA、RNA的存在部位。思考题1.简述PAS反应，Feulgen反应，Br