土壤酶测定方法

土壤酶测定方法Arylamidase（EC3.4.11.2）试剂：1、THA缓冲液（0.1，pH8.：2.44g三羟甲基氨基甲烷溶于50m用0.05MH2SO4滴定调节pH，加水稀释溶液至200mL。2、L-leucineβ-naphthylamidesolutionL-亮氨酸β-萘胺（8.0mM）(2mM)：称取0.2342gL-亮氨酸β-萘胺盐酸盐溶于水，定容至100mL。3、Ethanol乙醇：（95%）4Acidifiedethanol酸化乙醇0.26MHC4.32m浓HCl醇定容至200mL。5、p-Dimethylaminocinnamaldehydesolutionmg/mL)：0.12g对二甲氨基肉桂醛溶于乙醇，用乙醇定容至200mL。6、标准液β萘胺溶液（β-naphthylamin（125ug/m：称取12.5mgβ萘胺，75mL蒸馏水，5mL乙醇，用蒸馏水定容至100mL。7β-萘胺标准曲线标准液β-（125ug/mL）与25mLug/mLβ-步骤：1称取1土壤（mm）25mL3mL0.1M的THAM缓冲液（pH8.，1mL8.0mM的L亮氨酸β-混匀，密封，放置在震荡培养箱1。26mL乙醇至离心管，在17000xg离心1min。3、1mL上层清液至另1mLmLmL混合溶液涡旋混匀，红色偶氮化合物在540nm下比色。4、当红色偶氮化合物的浓度超过最高浓度的标准β-萘胺溶液，能整除的红色偶氮化合物用乙醇稀释，直到在表曲线上。按照每1mL标曲溶液，加入1mL乙醇，2mL酸化乙醇，2mL对二甲氨基肉桂醛。5、对照处理，1mL的基质在培养结束后加入。参照方法来自于：Acosta-Martı´NezV,TabatabaiMA.ArylmidaseActivityofSoils[J].SoilScienceSocietyofAmericaJournal,2000,64：215-221N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶N-acetyl-β-D-glucosaminidase（NAG，EC3.2.1.52）试剂：1、醋酸盐缓冲液（100mM，pH5.5）：醋酸钠(CH3COONa·3H2O)13.6g溶于800mL水中，用99%的冰醋酸滴定至pH为5.5，定容至1L。2Modifieduniversalbuffer(MUB5X储备液顺丁烯二酸maleciaci，柠檬酸citricaci,6.3硼酸H3BO3）溶488mL1M的NaOH5X储备液4oC保存。此溶液被滴定到想要的pH,用之前先用蒸馏水稀释5倍。2、底物p-Nitrophenyl-N-acetylβ-D-glucosaminide（10m：0.342gp-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide（对硝基苯乙酰基氨基葡萄糖苷溶于100mL醋酸盐缓冲液0.1M，pH5.5，4保存。3（CaC0.536.75gCaC2·2溶于400m500m。4、氢氧化钠（NaOH，0.5M）：10gNaOH溶于400mL水中，定容至500mL。5、标曲对硝基酚（p-nitrophenol）溶液：1.000gp-nitrophenol，溶于800mL中，定容至1L，4oC（1000ug/mL）6、标准曲线绘制：1mL标准对硝基酚溶液，定容至100mL（10ug/mL）。吸取5mL10，20，30，40，50ug对硝基酚。步骤：1、称取1g土壤于50mL三角瓶，加入4mL0.1M的醋酸盐缓冲液（pH，5.5）,1mL10mMp-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide，混匀，密封，37oC培养1h。2、培养结束后，加入1mL0.5M的CaCl2和4mL0.5M的NaOH终止反应，过滤，然后在405nm比色。3无土对照只加试剂，无基质对照培养结束后在0.5M的CaCl2和4mL0.5M的NaOH终止反应后，再加入基质。参照方法来自于：J.A.Parham,DengSP.Detection,quantificationandcharacterizationofβ-glucosaminidaseactivityinsoil[J].SoilBiology&Biochemistry,2000,32:1183-1190L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）L-谷氨酰胺酶（L-glutaminase）试剂：1、甲苯2THAM（0.1M,pH三羟甲基氨基甲烷溶于800mL0.1M的NaOH调节pH至10，定容至1。3L-天冬酰胺溶液（0.51.65gL天冬酰胺到25mTHAM液定容，混匀。4KCl（2.5100mgA2SO4溶于700m188KCl溶于硫酸银溶液，定容至1。步骤：1、称取5g土（2mm）在50mL0.2mL甲苯，9mL缓冲液，涡旋混匀，加入1mL0.5的L-37oC培养2h。2、 培养结束后，加入35mLKCl-Ag2SO4溶液，混匀，温度降低到室温（约5min，用KCl-A2SO溶液定容至50m，摇匀。3、 测定土壤悬浮液中NH4+-N，容量瓶摇匀，吸取整除的20mL悬浮液至mL蒸馏瓶，释放的NH4+-N用蒸馏法测定，0.2gMgO3min。4、 无机质对照，在培养结束后加入1mL0.5的天冬酰胺溶液（KCl-Ag2SO4溶液加入之后。参照方法来自于：FrankenbergerWT,Jr.,TabatabaiMA.L-Asparaginaseactivityofsoils[J].BiolFertilSoils1991,11:6-12.JrWTF,TabatabaiMA.L-glutaminaseactivityofsoils[J].SoilBiology&Biochemistry,1991,23(9):869-874.β-葡萄糖苷酶1、甲苯2、Modifieduniversalbuffer(MUB)3、对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷p-Nitrophenyl-β-D -glucopyranoside（mM）：称取377mg溶于40mLMUB(pH,6.0),用MUB定容至50mL。4、CaCl2（0.5：称取73.5gCaCl2·2H2O700mL1L.5、THAM(0.1M，pH12)：6、对硝基酚标准溶液：步骤：11g50mL0.25mLmLMUB(pHmL葡葡糖苷溶液，涡旋混匀，密封，在37oC培养1h。21mL0.5MCaC24mL0.1MTHA（pH1混匀，过滤。400nm比色。3MTHAM(pH稀释，直到吸光值在标曲上。41mL（1mL0.5M4mLMTHAM，pH12之后。参照方法来自于：EivaziF,TabatabaiMA.Glucosidasesandgalactosidasesinsoils[J].Biology&Biochemistry,1988,20(5):601-606.荧光二乙酸酯水解酶（FDA）：试剂：1、磷酸钠缓冲液称取22.74gNa3PO4·12H2O700mL定容至1。用1M的HCl调节pH。2、FDA底物（C24H16O7）：称取5mgFDA溶于10mL丙酮，使得溶液浓度为12.01uMFDAmL-1。3、荧光素标准溶液10mg荧光素（C20H12O5），10mL的丙酮的50mL容量瓶，用磷酸钠缓冲液（pH）定容至50mL，溶液浓度为602uM步骤：1