基因工程08课件

第8章PCR技术及其应用PCR技术原理和工作方式PCR产物的克隆PCR扩增未知DNA片段与反转录相关的PCRPCR产生DNA指纹实时定量PCR8.1PCR技术原理和工作方式8.1.1PCR的基本原理⒈基本要素和扩增原理待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA聚合酶在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。图8-1是PCR扩增前4轮产物的增长过程，每一轮包括3个步骤（变性、退火和延伸），从中可以看出PCR的整个扩增进程。图8-1PCR扩增反应原理图

延伸第四轮变性与退火变性与退火变性与退火变性与退火延伸延伸延伸01/41/211/16模板DNA目的产物所占比例第一轮第三轮第二轮⒉PCR扩增的步骤变性（denaturation）：将模板DNA置于92-96℃，使dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质；退火（annealing）：将温度降至37-72℃，使引物与模板的互补区相结合；延伸（extension）：在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3‘-OH端，合成DNA。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。8.1.2PCR反应体系⒈缓冲液标准的缓冲液含10mMTris·HCl，pH为8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72℃）下pH接近7.2。缓冲液中含有Mg2+或Mn2+，用于激活DNA聚合酶的活性中心。标准Mg2+浓度为1.5mM。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率，直接影响扩增的成败，因此要求作预备试验寻找最佳浓度。缓冲液中还含有50mM的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含G+C模板的扩增效率。⒊引物在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1μM，即1pmol/μl，在100μl反应体系中相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1kb的DNA片段，可得到3.3μg的产物，足以用于常规分析。引物设计要考虑的几个问题①长度：至少16bp，通常为18-30bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。②解链温度（Tm值）：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算即Tm=4（G+C）+2（A+T）。对于14-70个核苷酸的引物可用以下公式计算：Tm=81.5+16.6（lg[K+]）+0.41（G+C）%-（675/N）N表示引物的核苷酸数目，[K+]表示单价离子即钾离子的浓度。③避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），减少引物二聚体以及引物内部二级结构的形成。④G＋C含量尽量控制在40%-60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3′末端的重复排列。⑤引物的3′末端最好是G或C，但不要GC连排。⒌DNA聚合酶⑴TaqDNA聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermusaquaticus），TaqDNA聚合酶分子量大小为94kDa，为单分子酶，在75℃活性最强。具有5’→3’合成活性和5’→3’外切活性，但是无3’→5’外切活性。在95℃的半衰期为40分钟。启动PCR反应的能力很强，聚合速度快，在72℃的聚合速度为每秒30-100碱基。由于没有3’→5’外切活性，在扩增过程中有8.9×10-5-1.1×10-4错配率。Taq酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为AmpliTaq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因长2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括对dNTP结合，引物与模板作用区均存在于Taq酶中。

Taq酶没有3’→’5’外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中点突变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs浓度分别为200μmol/L，Mg2+为1.5mmol/L，在55℃退火)。不含3’→5’外切酶活性对测序有利。

⑵TthDNA聚合酶来自嗜热热细菌（Thermusthermophilus）HB8，由Promega公司开发成商品。TthDNA聚合酶分子量为94kDa，在74℃进行扩增，在95℃的半衰期为20分钟。在Mg2+存在条件下，以DNA为模板合成DNA，而在MnCl2存在下可以RNA为模板合成cDNA。因此可在高温下做RT-PCR、反转录和引物延伸反应，避免RNA反转录过程中形成的二级结构。⑷PwoDNA聚合酶

来自噬热细菌（Pyrococcuswoesei），大小为90kDa。在100℃的半衰期大于2h，出错率低。是使用较多的具有3’→5’外切酶活性的且具有高保真度的PCR酶。⑸PfuDNA聚合酶PfuDNA聚合酶来自激烈热球菌（Pyrococcusfariosus），具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性，是目前使用最广泛的具有3’→5’外切酶活性的PCR酶。⑹商用混合酶

为了提高扩增的保真度或扩增较长的DNA片段，将TaqDNA聚合酶的强启动能力和具有3'→5'外切酶活性的高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。⒉复性（退火）和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。⒊反应时间变性步骤一般使用30s，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30s一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1min来保证充足的时间。⒋循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104-105数量级时，循环数通常为25-35次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。⒌PCR反应液的配制PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。在使用具3‘→5’外切酶活性的高温DNA聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，

A管:含模板、引物和dNTP，以及调整体积的H2OB管:含缓冲液、DNA聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。热启动（hotstart）按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。在配制好反应体系后，引物就会与模板结合。在低温下非特异性的结合很容易发生，从而导致非特异性的扩增产物。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决这一问题。将dNTP、缓冲液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蜡珠（如AmpliWaxPCRQam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有当PCR反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。8.2PCR产物的克隆8.2.1在PCR产物两端添加限制性酶切位点为了使PCR产物能够方便的装载到克隆载体上，可在扩增的过程中在其两端添加限制性酶切位点。这种添加方式可利用特定设计的引物通过扩增来实现，而无须在产物的两端连接带酶切位点的接头（linker）。在设计引物时，除了考虑正常的特异性序列外，还可在引物的5‘末端添加酶切位点的序列以及保护序列。在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的DNA片段内部不存在。如果对扩增的DNA片段的序列不清楚，可优先选用切割频率相对较少甚至酶切位点为8个碱基序列的酶切位点。一般情况下，在酶切位点的外侧添加3-4个碱基的保护序列可保证切割顺利进行。8.2.2A/T克隆法无须在产物末端添加酶切位点，对任何引物扩增的产物都可以克隆。主要适用于TaqDNA聚合酶扩增的产物。TaqDNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可在DNA片段的3‘末端添加一个核苷酸，通常为A。最常用的T-载体有pGEM-T和pGEM-TEasy。这些载体特点是，将普通的克隆载体切成线状，并使之在3‘末端含有一个凸出碱基T。pGEM-T是在pGEM-5Zf（+）基础上改造而来的，即在其多克隆位点中的EcoRⅤ处将载体切成平末端的线状DNA，再在其3'末端添加一个T碱基。图8-2热稳定DNA聚合酶的末端转移酶活性C、A，测序相对分子质量标准；Taq和Pwo指用相同的模板和相同的药物分别用TaqDNA聚合酶和PwoDNA聚合酶扩增的产物。图8-3用于PCR产物克隆的T载体pGEM-T图谱图8-4pCR-TOPO载体及其工作模式图左图为载体的图谱，右图为载体中拓扑异构酶的工作模式图。8.2.3平末端DNA片段的克隆⒈pPCR-ScriptAmpSK（＋）克隆载体该载体从pBluescriptⅡSK（+）噬菌粒改造而来，只是将多克隆位点中的XbaⅠ和SpeⅠ位点改成SrfⅠ位点（5′-GCCC/GGGC-3′）。克隆DNA片段时，先将载体用SrfⅠ切成线状，再与目标DNA片段混合作连接反应。在连接体系中除了添加T4DNA连接酶外，还加入SrfⅠ酶。图8-5pPCR-ScriptAmpSK（＋）载体克隆平末端DNA示意图DNA当载体发生自连后，SrfⅠ酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中。只有当载体与目的DNA片段连接后，酶学反应才能稳定下来，从而将总体的反应平衡向载体与目的DNA片段连接这个方向倾斜。⒉pPCR-Blunt克隆载体pPCR-Blunt是另一种用于提高克隆平末端片段效率的载体，该载体最大特点是在lacZ‘基因的下游融合了一个ccdB

基因（图8-6），该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为3.5kb，含卡那霉素抗性基因和zerocin抗性基因。在克隆外源平末端DNA片段时，先将载体切成线状，再与目的DNA连接，转化大肠杆菌。如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源DNA片段与载体连接后，ccdB基因的表达受到阻断，重组质粒的大肠杆菌才能存活下来。Zeocin是一种属于争光霉素家族的糖蛋白抗生素图8-6克隆平末端DNA的pPCR-Blunt载体图谱8.2.4长片段DNA的PCR扩增(自学）在常规的PCR反应中，其产物一般在2kb以下。为了提高扩增产物的长度，使用扩增效率高、延伸能力强的TaqDNA聚合酶；少量使用具有3‘→5’外切酶活性的高温DNA聚合酶（如Pfu或PwoDNA聚合酶），及时切除不匹配碱基的掺入。如将TaqDNA聚合酶和PwoDNA聚合酶结合起来的长片段PCR扩增试剂盒，可扩增长达40kb的DNA片段（图8-7）。图8-7利用PCR长片段扩增体系扩增噬菌体DNA10-40kb片段3-9扩增片段的大小分别是10、15、20、25、30、35和40kb，其余为相对分子质量标准8.3PCR扩增未知DNA片段当获得一段DNA后，若要得到与其相邻的未知DNA片段，可通过染色体步查来完成。染色体步查是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得或探知其相邻的未知序列或与已知序列呈共线性关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。8.3.1反向PCR反向PCR（inversePCR）是一种简单的扩增已知序列周边未知序列的方法，其扩增原理见图8-8。首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。图8-8反向PCR原理示意图8.3.2利用接头的PCR这类方法的第一步通常都是将基因组DNA用限制性内切酶切割，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段两端，以提供PCR需要的另一端引物。根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，可将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。图8-9利用3′末端修饰的接头扩增未知DNA片段接头一端为平末端，另一端为长长的5′突出末端，而且在3′凹端带有一个修饰的氨基（-NH2），修饰的末端在PCR扩增时不能作为引物启动DNA的合成。首先选择合适的酶切位点酶切总基因组，将人工合成的接头连接在酶切片段两端，然后再做PCR扩增。PCR扩增的引物是根据接头的突出末端序列而设计的引物LP1和LP2，以及根据已知序列设计的引物SP1和SP2。8.3.3热不对称交错PCRTAIL-PCR:thermalasymmetricinterlacedPCR利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成：

①由特异性引物和简并引物扩增出的产物(I型产物）；

②由同一特异性引物扩增出的产物（II型产物）；

③由同一简并引物扩增出的产物（III型产物）。TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（specialprimer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrarydegenerateprime，AD，约14bp）相组合，以基因组为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR共分3次反应。TAIL-PCR用特殊的热循环程序使PCR反应有利于Ⅰ型产物的扩增，而抑制Ⅲ型非特异性产物。其中使用了较长的高退火温度的嵌套特异引物和较短的低退火温度的随机简并引物，它们的退火温度明显不同。通过控制退火温度可控制何种引物占优势，从而控制产物的扩增。首先进行5轮高严谨度的扩增，此时主要是特异性的引物起作用，单向扩增目的单链DNA。然后进行一个低严谨度的PCR循环，随机简并引物起作用，此前线性扩增的目的DNA产物可变成双链。在随后的扩增中高严谨度和中严谨度循环交错进行，使目的序列的扩增大大超过非特异产物，从而控制特异产物和非特异产物的生成比例（图8-10）。最后再使用一个嵌套特异性引物进行第二次TAIL-PCR，可以得到大量的特异性产物。图8-10TAIL-PCR工作流程图8.4与反转录相关的PCR8.4.1cDNA末端的快速扩增在cDNA克隆时常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆，并且筛选文库只能回收一个或几个cDNA克隆，而cDNA末端的快速扩增（rapidamplificationofcDNAend,RACE）则可产生大量独立克隆。⒈cDNA5′末端的快速扩增RACEPCR提供了一种快速扩增cDNA5′末端的方法（5′-RACE）。首先测定已经得到的cDNA的核苷酸序列，根据这个序列设计一个与靠近5‘末端区域序列对应的特异性引物（如GSP1）并以这个引物引导反转录合成新的cDNA第一链，如图8-11所示。然后用RNase降解模板mRNA，并纯化cDNA第一链；用末端转移酶在cDNA第一链3′末端加上同聚物尾，如polyC，最后用特异性引物GSP2和复合引物（abridgedanchorprimer，该引物由两部分组成，靠3′末端为同聚物G，靠5′末端为带有酶切位点的固定序列）对加了尾的cDNA第一链作PCR扩增，从而得到含有cDNA5′末端的DNA片段。GSP:genespecificprimers

图8-115′-RACE原理示意图⒉cDNA3′末端的快速扩增利用类似5′-RACE的3′-RACE方法可以快速扩增cDNA的3′末端序列。首先用一个接头引物合成cDNA第一链。该引物由两部分组成，靠3′端为同聚物T，靠5′端为带有酶切位点的固定序列。然后用RNase降解模板mRNA，纯化cDNA第一链；用接头引物和根据已知序列合成的特异性引物GSP对cDNA第一链作PCR扩增，从而得到含有3‘末端的DNA片段。图8-12为3'-RACE的原理示意图。图8-123′-RACE原理示意图8.4.2差异显示PCR差异显示PCR（differentialdisplayPCR,DD-PCR）是用于检测相似生物材料的基因表达谱差异的一种方法，是PCR和反转录有机结合并深化应用的产物。其包括3个基本步骤和2个附加步骤，如图8-13所示。图8-13DD-PCR原理示意图

A．DDRT-PCR分析的原理。N代表4种核苷酸的任何一种，V代表除T之外的其他核苷酸。B代表除A之外的其他核苷酸。B．证实差异调节及鉴定差异表达基因的DDRT-PCR分析的实验流程图。mRNA差异显示PCR（differentialdisplayreversetranscriptinPCR,DDRT-PCR）1990年梁鹏等人发明。通过两种材料的对比获得某一材料特异表达的基因。将RT-PCR和SCREENNING技术结合起来。该法简便快捷，带有较多的假阳性。DDRT－PCRDDRT－PCR原理总RNA反转录酶锚定引物叶子花总RNA反转录酶锚定引物产物A产物B锚定引物随机引物标记_+AB克隆验证测序真核生物12种mRNA的序列特点

8.5PCR产生DNA指纹8.5.1多重PCR在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR就称为多重PCR（multiplexPCR），其结果产生多个PCR产物。通过比较扩增产物的大小和预期设计的大小，可判断样品中含有哪些基因。多重PCR可用于等位基因的鉴定。图8-14显示YBT-1520菌株所含的cry1A杀虫基因的类型，从扩增产物的大小可说明该菌株含有cry1Aa、cry1Ab和cry1Ac基因从克隆得到的基因为cry1Ac。图8-14苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的杀虫晶体蛋白基因的PCR鉴定图中1为利用cry1A基因特异性的混合引物对该菌株扩增出大小对应于cry1Aa、cry1Ab和cry1Ac基因的PCR产物；2为从该菌株中克隆到的cry218基因经PCR鉴定属于cry1Ac基因；M为相对分子质量标准。8.5.2随机扩增多态性DNA随着引物的长度缩短，在基因组DNA上出现与之互补配对序列的几率进一步增加，PCR扩增后产物的数量也随之增加。当引物的长度缩短到一定程度后，单一引物就可以扩增出多个DNA产物。根据这一现象，人们设计出一种建立随机扩增多态性DNA（randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）的方法。用长度为10个或11个碱基的单一固定序列引物（arbitraryprimer）可扩增出随机大小的DNA片段，产生DNA片段的多态性，也就是DNA指纹。RAPD使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。原理示意图

若位点2处碱基发生改变

8.5.3扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）分析是针对基因组DNA的限制性酶切片段进行选择性PCR扩增从而建立DNA指纹的技术。首先将基因组DNA以两种限制性内切酶完全切割，之后再将合成的并与这两个限制酶产生的末端相对应的接头(adapter)与酶切DNA片段的两端连接。然后以含有接头序列和酶切位点序列的引物对连接产物作PCR扩增。最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行PCR产物分离，从而产生DNA指纹。AFLP原理由于不同物种的基因组DNA大小不同,基组DNA经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对摸板DNA进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检出多态性RFLP原理图示限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism)8.6实时定量PCR通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好地推算模板的起始浓度。这种工作方式就称为实时PCR（real-timePCR）。同时由于在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，所以亦称实时荧光PCR或实时荧光定量PCR。该技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司设计并推出，其应用不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃。8.6.1实时荧光定量PCR的定量方式通过荧光信号的强度来显示在每一轮反应中新增产物的数量。在PCR扩增的前期循环中，荧光信号的强度呈现平缓的波动状态，经过一定数量的扩增循环后荧光信号的强度由本底进入指数增长阶段。将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为阈值（threshold），荧光信号达到阈值所对应的循环次数称为Ct值。实验操作中，Ct值是指在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光强度所对应的PCR循环次数。阈值的设定非常重要，一般PCR反应的前